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腫瘤細(xì)胞特點(diǎn)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

 更新時(shí)間:2023-06-20 點(diǎn)擊量:758

  腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占據(jù)較為重要地位。腫瘤細(xì)胞相對(duì)容易培養(yǎng),腫瘤細(xì)胞系是目前建立的細(xì)胞類型中數(shù)量較多的。此外,腫瘤是人類疾病的大威脅。因此,腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)已成為了解癌癥機(jī)制和開發(fā)抗癌藥物的新技術(shù)。本指南旨在作為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的基本介紹,包括培養(yǎng)基、傳代培養(yǎng)、冷凍保存和污染防治。

腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性

腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)外與正常細(xì)胞在形態(tài)、生長值、遺傳性狀等方面均有顯著差異。體外培養(yǎng)的兩種腫瘤細(xì)胞定義的差異很小,但卻不相同。培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞具有以下特征:

1.不斷分化,持續(xù)生長

正常細(xì)胞的生長和死亡受到嚴(yán)格控制。細(xì)胞使用細(xì)胞外信號(hào)來調(diào)節(jié)分裂的速率和位置。一般來說,細(xì)胞凋亡可以由正常的生命程序觸發(fā)。相反,腫瘤細(xì)胞提供了一種機(jī)制,使它們能夠繞過細(xì)胞周期檢查點(diǎn)并抑制細(xì)胞凋亡。在癌細(xì)胞中,有絲分裂可以連續(xù)發(fā)生,產(chǎn)生過多的細(xì)胞以形成腫瘤。

腫瘤細(xì)胞正常凋亡

2.無接觸抑制

正常細(xì)胞會(huì)分裂,直到它們與鄰近的細(xì)胞接觸,然后它們會(huì)停止生長并形成單層細(xì)胞。而癌細(xì)胞通常會(huì)失去這種接觸抑制,導(dǎo)致它們堆積并形成腫瘤。

腫瘤的擴(kuò)散

3.侵入性

正常細(xì)胞通常位于固定位置直至死亡。但是腫瘤細(xì)胞能夠擴(kuò)散到或侵入附近的組織。此外,一些腫瘤細(xì)胞可以脫落并通過血液或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到體內(nèi)遠(yuǎn)處,形成遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤的新腫瘤。

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)原理

細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識(shí)現(xiàn)在相對(duì)普遍,盡管并非總是如此。細(xì)胞培養(yǎng)的主要條件是光線充足且通風(fēng)良好的實(shí)驗(yàn)室,配備的實(shí)驗(yàn)室儀器應(yīng)包括層流罩(II 級(jí))、CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜、臺(tái)式離心機(jī)、顯微鏡、塑料器皿(燒瓶和培養(yǎng)板)以及含有或不含血清補(bǔ)充劑的培養(yǎng)基.

養(yǎng)基和血清

大多數(shù)培養(yǎng)基是添加了各種成分的基礎(chǔ)鹽水培養(yǎng)基。在這種含鹽培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,添加了氨基酸、維生素、金屬離子、微量元素和能量來源(通常以葡萄糖形式提供)以滿足細(xì)胞的需要。其他添加劑包括緩沖液和酚紅以指示培養(yǎng)物的酸度。

表 1. 常用培養(yǎng)基。

類型

應(yīng)用

基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (BME)

二倍體和原代細(xì)胞培養(yǎng)物,例如 HeLa、L 細(xì)胞和原代哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞

非必需培養(yǎng)基 (MEM)

懸浮和貼壁哺乳動(dòng)物細(xì)胞

細(xì)胞因子

保護(hù)和維持大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長

細(xì)胞生長因子

人微血管內(nèi)皮細(xì)胞

RPMI 1640

大多數(shù)哺乳動(dòng)物和雜瘤細(xì)胞,例如人類骨髓瘤、小鼠雜瘤、人類白細(xì)胞、B 和 T 淋巴細(xì)胞

   血清通常被添加到上述培養(yǎng)基中以替代許多缺失的需求。存在的成分濃度通常在 5-20% 之間變化,具體取決于細(xì)胞類型,并且使用新生兒或胎牛血清的做法已變得很普遍。由于批次之間存在差異,因此最好堅(jiān)持使用一家發(fā)現(xiàn)與特定細(xì)胞系合作良好的供應(yīng)商。血清可分成等分試樣并冷凍在-20°C。

有些細(xì)胞類型不能在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng),例如人微血管內(nèi)皮細(xì)胞。在現(xiàn)有的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加特定的添加劑或增加各種成分的濃度都可以滿足特殊要求。 

繼代培養(yǎng)

傳代培養(yǎng)是通過將部分或全部細(xì)胞從以前的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮的生長培養(yǎng)基中而產(chǎn)生新細(xì)胞或微生物培養(yǎng)物的過程。不同的細(xì)胞類型具有特定的傳代培養(yǎng)要求、優(yōu)選的密度范圍和最佳生長的良好條件。所以更多的細(xì)節(jié)請(qǐng)參考我們網(wǎng)站上的具體技術(shù)公告。

冷凍保存

 為了有效地儲(chǔ)存細(xì)胞,然后回收足夠高的比例用于質(zhì)量研究,必須監(jiān)測(cè)儲(chǔ)存條件并保存良好的記錄。

  凍融引起的細(xì)胞損傷一般認(rèn)為是由細(xì)胞內(nèi)冰晶和滲透作用引起的。添加冷凍保護(hù)劑,如二甲基亞砜 (DMSO) 或甘油,并選擇合適的冷凍和解凍速率可最大限度地減少細(xì)胞損傷。雖然可以使用機(jī)械冷凍機(jī) (-75°C) 短期儲(chǔ)存細(xì)胞系,但更優(yōu)選儲(chǔ)存在液氮 (-196°C) 或其蒸氣(至 -135°C)中。使用液氮冰箱是有利的,不僅因?yàn)檩^低的溫度,因此幾乎可以無限存儲(chǔ)時(shí)間,而且還因?yàn)闆]有機(jī)械故障的風(fēng)險(xiǎn),并且現(xiàn)在可以延長保存時(shí)間。

細(xì)胞培養(yǎng)過程中的污染

細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)染色無菌,定期進(jìn)行無菌檢測(cè)是必要的。雖然細(xì)胞培養(yǎng)物可能在內(nèi)源性(主要是病毒)感染中產(chǎn)生,但大多數(shù)感染和污染是后天獲得的。以下是一些常見的文化污染,但不限于:

細(xì)菌

細(xì)菌是一大群普遍存在的單細(xì)胞微生物。由于它們的普遍存在、大小和快速生長速度,細(xì)菌是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的生物污染物之一。如果存在,通過肉眼觀察很容易檢測(cè)到酚紅會(huì)變黃,并且在倒置顯微鏡下細(xì)胞會(huì)被細(xì)菌菌落取代。向培養(yǎng)物中添加抗生素是常見的做法,這可以在相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)掩蓋低水平感染。

細(xì)菌感染 圖4

霉菌

霉菌是真菌界的真核微生物。與細(xì)菌污染不同,培養(yǎng)物的 pH 值在污染的初始階段會(huì)保持穩(wěn)定,然后隨著培養(yǎng)物受到更嚴(yán)重的感染并變得混濁而迅速升高。在顯微鏡下,通常會(huì)出現(xiàn)菌絲體。一般來說,在培養(yǎng)物中加入抗生素,就能在一定程度上降低感染程度。

霉菌污染5

酵母菌

酵母是單細(xì)胞真核微生物,類似于霉菌污染,被酵母污染的培養(yǎng)物變得渾濁,特別是如果污染處于晚期。被酵母污染的培養(yǎng)物的 pH 值可能不會(huì)變化太多,直到污染變重,在這個(gè)階段 pH 值通常會(huì)增加。在顯微鏡下,很明顯酵母表現(xiàn)為單個(gè)卵形或球形顆粒,甚至可能會(huì)長出更小的顆粒。向培養(yǎng)物中添加抗生素效果不佳。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室通常會(huì)處理受感染的培養(yǎng)物并重新開始。

酵母污染6

酵母污染細(xì)胞

支原體

支原體可能是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中最常見和最容易被遺漏的感染,其影響是陰險(xiǎn)的??赡艽嬖趩栴}的指標(biāo)包括生長速度降低、形態(tài)變化、染色體畸變和新陳代謝改變。有多種檢測(cè)支原體的方法,可以使用支原體清除試劑盒進(jìn)行清除或預(yù)防。

病毒

一些細(xì)胞系包含病毒,包括整合到它們的基因組中,或作為內(nèi)源性非致死性感染。在許多情況下,這些不被視為感染,細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)化是產(chǎn)生連續(xù)細(xì)胞系的歷史悠久的方法。然而,使用病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員造成嚴(yán)重的健康危害,尤其是在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)人類或靈長類動(dòng)物細(xì)胞時(shí)。

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