用肉眼或光學(xué)顯微鏡檢測(cè)支原體比較困難，所以支原體檢測(cè)一般會(huì)通過(guò)PCR 的檢測(cè)、DNA 染色、熒光標(biāo)記、瓊脂平板接種等 方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。在支原體檢測(cè)之前，細(xì)胞應(yīng)連續(xù)培養(yǎng)至少兩周，以便有時(shí)間讓低水平的污染物生長(zhǎng)。對(duì)于測(cè)試，在取樣前至少兩三天內(nèi)不應(yīng)更換培養(yǎng)基。
一、培養(yǎng)法
在瓊脂平板/肉湯上培養(yǎng)被認(rèn)為是檢測(cè)支原體的“金標(biāo)準(zhǔn)"。在這種方法中，將細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液添加到液體或半固體培養(yǎng)基（含有支原體生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)）中。受感染的細(xì)胞培養(yǎng)物會(huì)在液體肉湯和瓊脂平板上生長(zhǎng)。瓊脂平板上很容易看到支原體菌落。這種方法能夠檢測(cè)大多數(shù)支原體種類(lèi)，除了少數(shù)種類(lèi)。
二、PCR法
另一種用于檢測(cè)支原體的方法是使用 PCR。在該技術(shù)中，使用了對(duì)各種常見(jiàn)感染性支原體的 16s RNA 基因特異的 PCR 引物。范圍廣泛的引物涵蓋了幾乎所有的感染性支原體。該過(guò)程中使用的引物是物種/基因特異性或通用的。這種方法快速、高效、可靠且具有成本效益。
基于傳感器細(xì)胞的方法使用專(zhuān)門(mén)的細(xì)胞來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)物中支原體的存在。一旦這些細(xì)胞檢測(cè)到支原體，它們就會(huì)引發(fā)一系列化學(xué)反應(yīng)，從而引起明顯的顏色變化。該方法靈敏度高但特異性低(Degeling, 2012)。
三、使用支原體檢測(cè)試劑盒
生物發(fā)光檢測(cè)試劑盒可從不同的生物技術(shù)公司獲得，這些試劑盒是基于酶的支原體檢測(cè)試劑盒。這些試劑盒可檢測(cè)不是由真核細(xì)胞合成的支原體酶。首先，試劑盒成分會(huì)破壞支原體，然后使用特定的酶來(lái)觸發(fā)產(chǎn)生發(fā)光的細(xì)胞機(jī)制。然后可以通過(guò)光度計(jì)檢測(cè)到這一點(diǎn)。
可以在受感染的培養(yǎng)基中加入非特異性 DNA 染料來(lái)檢測(cè)支原體。當(dāng)在熒光顯微鏡下觀(guān)察時(shí)，支原體 DNA 以小簇的形式出現(xiàn)，與細(xì)胞 DNA 分開(kāi)。
四、熒光染色法
熒光 DNA 染色是另一種 DNA 染色方法。此方法使用 DAPI 和 Hoechst 33258 等 DNA 染料對(duì)所有 DNA 進(jìn)行染色。在此過(guò)程中需要一些專(zhuān)業(yè)知識(shí)，因?yàn)榻Y(jié)果解釋可能很困難。支原體的低密度、其他細(xì)菌的污染或這些細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)胞外熒光信號(hào)會(huì)阻礙正確的結(jié)果解釋。此外，來(lái)自核區(qū)域的信號(hào)使支原體的檢測(cè)變得困難。
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預(yù)防支原體污染的方法
1. 加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室操作管理：嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)室操作，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)服的消毒除菌，要求實(shí)驗(yàn)室工作人員戴口罩和手套，保證實(shí)驗(yàn)室的清潔。
比如通過(guò)培訓(xùn)合格的細(xì)胞培養(yǎng)人員，從而消除不規(guī)范操作所引起的支原體污染。如果可能，應(yīng)提供一個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)室用于細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞系的維護(hù)。為實(shí)驗(yàn)室設(shè)施提供這樣的環(huán)境不僅可以減少支原體，還可以避免其他細(xì)菌和真菌污染。
另外要做好細(xì)胞室的消毒工作，熟練掌握季銨酸鹽消毒液、醇類(lèi)消毒液、殺孢子劑等消毒劑的使用方法，同時(shí)做好個(gè)人防護(hù)工作，比如：工作時(shí)戴上手套，使用后丟棄。確保定期更換手套和口罩，而不是將它們放在實(shí)驗(yàn)室外套的口袋里。
為實(shí)驗(yàn)室配備單獨(dú)的鞋子，以避免帶入細(xì)菌和環(huán)境污染物。
還有需要注意的是人類(lèi)口腔中其實(shí)也含有多種支原體，當(dāng)你說(shuō)話(huà)、大笑、打噴嚏或咳嗽時(shí)，支原體也可能會(huì)進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)物。所以細(xì)胞室內(nèi)盡量避免在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)打噴嚏或咳嗽或大聲說(shuō)話(huà)。
2. 更換污染的細(xì)胞源：更換污染的細(xì)胞源，以確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和發(fā)育。
被污染的細(xì)胞源是支原體污染擴(kuò)散的主要途徑之一。所以，已被污染的細(xì)胞可以直接丟棄，避免造成交叉污染，除非價(jià)格較高或典型樣品。
3. 采用有效的消毒措施：采用有效的消毒措施，如紫外線(xiàn)消毒、甲醛消毒等，有效殺滅細(xì)胞污染源。
4.細(xì)胞傳代培養(yǎng)前要做好支原體污染檢查
A.細(xì)胞使用前也需要檢查細(xì)胞系儲(chǔ)備液是否存在支原體污染。
B.確保用于傳代培養(yǎng)的血清中不存在污染。避免使用過(guò)期產(chǎn)品或存放時(shí)間較長(zhǎng)的試劑。
C.盡可能使用新鮮的培養(yǎng)基和密封緊密的培養(yǎng)基。
D.使用一次性移液器以避免交叉污染。
E.確保在工作之前和期間將所有必需的設(shè)備和試劑放在層流氣流中。
F.在使用細(xì)胞系進(jìn)行檢測(cè)或分析之前，對(duì)支原體污染進(jìn)行常規(guī)檢查。
G.可以選擇使用 0.1 微米過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌，可以減少支原體污染的發(fā)生。
H.避免細(xì)胞培養(yǎng)物長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中，并確保在將它們放入培養(yǎng)箱之前擰緊瓶蓋。以防止氣溶膠污染。盡量以小瓶的形式對(duì)冷凍保存的細(xì)胞系進(jìn)行備份，即使冷凍保存細(xì)胞的活力隨著每次傳代培養(yǎng)而降低。
5.實(shí)驗(yàn)室設(shè)備與支原體污染
定期熏蒸層流和實(shí)驗(yàn)室設(shè)施也可以有效降低支原體污染的發(fā)生概率。
用于細(xì)胞培養(yǎng)的CO 2培養(yǎng)箱不得過(guò)度擁擠（填充不超過(guò)其容量的 60%），否則會(huì)導(dǎo)致支原體從一種細(xì)胞系感染到另一種細(xì)胞系。
多個(gè)細(xì)胞系不應(yīng)儲(chǔ)存在一個(gè)培養(yǎng)箱中，因?yàn)樗鼤?huì)增加交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。
應(yīng)定期清潔 CO2 培養(yǎng)箱，避免任何形式的潮濕。為保持濕度而提供的蒸餾水應(yīng)定期更換，因?yàn)橹гw、細(xì)菌和真菌可以駐留在這些容器中。
水浴鍋、液氮容器、試劑瓶等感染源必須定期清洗，定期檢查有無(wú)污染。
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支原體污染的處理辦法：
那么你發(fā)現(xiàn)了支原體污染，你接下來(lái)要做什么？直接的方法是丟棄受感染的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。在樣本不可替代或非常昂貴的情況下，只能采取一些方法進(jìn)行支原體清除來(lái)彌補(bǔ)損失。
支原體清除是一個(gè)非常耗時(shí)的過(guò)程，并且會(huì)增加對(duì)其他健康細(xì)胞系造成二次污染的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)感染的嚴(yán)重程度，支原體清除可能需要幾周到幾個(gè)月的時(shí)間。 支必清是一種使用廣泛支原體清除試劑，可以清除培養(yǎng)基中存在的大部分支原體。此外，BM Cyclin、氟喹諾酮環(huán)丙沙星、ciprobay、zagam、baytril、四環(huán)素等藥物也可用于從受感染培養(yǎng)物中去除支原體。
支必清可以有效去除大部分支原體污染，使用方便，對(duì)廣泛的支原體有效。雖然這些方法不能保證去除支原體，但可以去除大部分支原體污染。總的來(lái)說(shuō)，在進(jìn)行支原體清除時(shí)，是會(huì)影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞活力的。
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