我們知道開始培養(yǎng)的細(xì)胞不能無限期地生長，因?yàn)槭芟迏^(qū)域內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量不斷增加，營養(yǎng)物質(zhì)也會被消耗，從而 導(dǎo)致有毒的代謝產(chǎn)物增加，另外根據(jù)實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)需要，也要對細(xì)胞進(jìn)行 擴(kuò)大培養(yǎng)。通過去除培養(yǎng)基并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮的生長培養(yǎng)基和基質(zhì)中，細(xì)胞獲得了新鮮的營養(yǎng)并去除了有毒代謝物，從而可以長期維持培養(yǎng)。這個過程就屬于傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的 細(xì)胞 密度會低于原始培養(yǎng)物中的細(xì)胞密度。當(dāng)接種細(xì)胞后， 細(xì)胞生長會經(jīng)過滯后期、對數(shù)期，穩(wěn)定期 和凋亡期。在凋亡期，細(xì)胞會因缺乏營養(yǎng)或培養(yǎng)條件不當(dāng)而死亡。貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)步驟如下：
一、細(xì)胞檢查
細(xì)胞解凍后需要進(jìn)行細(xì)胞狀態(tài)檢查，確保細(xì)胞生長狀態(tài)正常，確保無細(xì)菌污染、無支原體污染。培養(yǎng)貼壁細(xì)胞時，主要貼壁于培養(yǎng)皿或燒瓶底部，培養(yǎng)基呈粉橙色。由于培養(yǎng)基中細(xì)胞（或污染）的代謝產(chǎn)物酸化，pH 指示劑酚紅變黃。MDCK 細(xì)胞在對數(shù)生長期呈多邊形，單層生長。使用正常的明場照明很難看到它們。通過切換到相襯，可以更容易地識別細(xì)胞。
記錄細(xì)胞狀態(tài)對于確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致非常重要。通過活細(xì)胞成像儀可以通過遠(yuǎn)程控制輕松成像和保存。研究人員可以拍攝細(xì)胞圖像以跟蹤培養(yǎng)狀態(tài)并將圖像傳輸?shù)街悄茉O(shè)備或 U 盤。
二、細(xì)胞收獲
1.將培養(yǎng)基從細(xì)胞中吸出到廢物容器中。也可以使用連接到瑞寧的真空吸液器。
2.用 5 ml 不含 Ca 和 Mg 的預(yù)熱 PBS 小心洗滌細(xì)胞最多 3 次，以去除殘留培養(yǎng)基中的胎牛血清 (FBS)。FBS 或 FBS 替代品會抑制胰蛋白酶。加入 3 ml 含EDTA的胰蛋白酶并輕輕晃動覆蓋貼壁的細(xì)胞并在 37°C的水浴鍋中孵育并解離細(xì)胞。 不同的細(xì)胞系需要不同的胰蛋白酶孵育時間。為避免過度胰蛋白酶消化會損壞細(xì)胞，請每隔幾分鐘在顯微鏡下檢查一次。
3.輕輕沖洗板并將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到 50 ml 試管中，并以 800 rpm 的速度向下旋轉(zhuǎn) 5 分鐘
分離的細(xì)胞應(yīng)呈圓形并在胰蛋白酶溶液中自由漂浮。一旦細(xì)胞分離，向培養(yǎng)皿中加入 5 ml 培養(yǎng)基以使胰蛋白酶失活。
4. 分離的細(xì)胞應(yīng)該是圓形的并且在胰蛋白酶溶液中自由漂浮。
三、細(xì)胞計(jì)數(shù)
1. 由于臺盼藍(lán)可以選擇性地穿透死細(xì)胞的細(xì)胞膜將死細(xì)胞染成藍(lán)色，所以使用臺盼藍(lán)溶液染色有利于觀察細(xì)胞的活力。根據(jù)這一特點(diǎn)我們將100UL細(xì)胞懸浮液與100UL的 0.4% 的臺盼藍(lán)溶液混合均勻后，再進(jìn)行細(xì)胞觀察。
2.將移液器吸頭放在蓋玻片邊緣并輕輕排出細(xì)胞懸浮液，從而將細(xì)胞懸浮液裝入計(jì)數(shù)室（每個計(jì)數(shù)區(qū)約 4 µl）。蓋玻片下的區(qū)域通過毛細(xì)管作用填充。
3.將細(xì)胞計(jì)數(shù)板放在細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
四、稀釋
1.將所需體積的細(xì)胞（適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞）以所需的分流比（此處為 1:10）吸取到新培養(yǎng)皿中，然后用培養(yǎng)基將其加滿至每個培養(yǎng)皿中所需的體積（10 毫升）。注意培養(yǎng)皿蓋上的細(xì)胞類型、細(xì)胞分裂日期和傳代數(shù)。將細(xì)胞放回 37°C 的培養(yǎng)箱中。
2.以所需的分流比將所需體積的細(xì)胞（適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞）移入新培養(yǎng)皿中。
讓細(xì)胞過夜以恢復(fù)和沉淀。24 小時后，用顯微鏡檢查細(xì)胞的形狀、粘附和是否存在污染。
3.細(xì)胞應(yīng)該附著在培養(yǎng)皿底部并且已經(jīng)開始生長和分裂。更換培養(yǎng)基以去除任何殘留的解離劑或細(xì)胞碎片。培養(yǎng)細(xì)胞直到它們?nèi)诤喜?zhǔn)備好進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或下一次傳代培養(yǎng)。
4.細(xì)胞應(yīng)當(dāng)附著在培養(yǎng)皿底部并開始生長和分裂。
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