熒光蛋白Marker優(yōu)化方案
有報道稱一種自預(yù)染熒光蛋白Marker，能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白Marker即是預(yù)染蛋白又是曝光蛋白。 具體原理是：將天然提取的熒光蛋白（包括藻紅蛋白、藻藍蛋白、別 藻藍蛋白、綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白等，其分子量為 20-300kDa），與能夠結(jié)合抗體IgG的proteinA、proteinG和能被二抗結(jié)合的抗體Fc區(qū)蛋白或肽共價偶聯(lián)，由于熒光蛋白自帶顏色，從而實現(xiàn)蛋白即是預(yù)染蛋白，又是熒光蛋白的目的，無需轉(zhuǎn)膜染色或X光片成像，此外，熒光蛋白Marker條帶可特異性結(jié)合一抗或者二抗，使蛋白樣品和蛋白marker 經(jīng)化學(xué)發(fā)光檢測后，能夠同時在X光片上顯示出來。
此方法的優(yōu)點克服了預(yù)染蛋白Marker的化學(xué)修飾（染料屬于有機化合物），只是將不同功能的蛋白或多肽偶聯(lián)在一起（類似于融合蛋白），不會出現(xiàn)電泳遷移變化，蛋白分子量不準(zhǔn)確的現(xiàn)象；也不會影響和膜的結(jié)合能力，能夠很好的提示轉(zhuǎn)膜情況；還能實現(xiàn)蛋白Marker與目標(biāo)蛋白顯示在同一張照片上。缺點是需要將天然提取的熒光蛋白經(jīng)過復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)上識別抗體的蛋白或多肽才能實現(xiàn)共同曝光在一張照片上，此過程操作復(fù)雜繁瑣，還會造成批間差異。
熒光蛋白Marker優(yōu)化方案
方案一：利用色素蛋白Marker代替預(yù)染Marker，此類蛋白包括含鐵卟啉的色素蛋白質(zhì)、含黃素的色素蛋白質(zhì)和含胡蘿卜素的色素蛋白質(zhì)等。由于蛋白沒有進行化學(xué)修飾，不會出現(xiàn)預(yù)染蛋白Marker因為經(jīng)過化學(xué)修飾后在SDS-PAGE電泳過程中遷移率發(fā)生改變，分子量信息不再準(zhǔn)確的現(xiàn)象，也不會影響和膜的結(jié)合能力，肉眼就可以觀察轉(zhuǎn)膜效率。曝光的時候，需要集普通掃描儀（類似照相機）和ECL掃描儀或者熒光掃描儀為一體的設(shè)備，先通過普通掃描儀將色素蛋白Marker成像，然后利用ECL掃描儀或者熒光掃描儀將目標(biāo)蛋白成像，再利用軟件將這兩種照片整合在一起，由于是同一張膜，拍照未挪動位置，只是進行二次不同捕光原理成像，就不存在拼接導(dǎo)致位置錯誤，并且照片是由專業(yè)軟件整合，不會出現(xiàn)修改和拼接痕跡。缺點是需要集普通掃描儀（類似照相機）和ECL掃描儀或者熒光掃描儀為一體的設(shè)備。
方案二：利用熒光蛋白的顏色（帶顏色的熒光蛋白，例如藻紅蛋白、藻藍蛋白、別 藻藍蛋白、綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白等，代替預(yù)染），肉眼就可以判斷轉(zhuǎn)膜效率。同色素蛋白一樣，由于蛋白沒有進行化學(xué)修飾，不會出現(xiàn)電泳遷移變化，蛋白分子量不準(zhǔn)確的現(xiàn)象；也不會影響和膜的結(jié)合能力，能夠很好的提示轉(zhuǎn)膜情況。優(yōu)點得到的熒光蛋白不需要進行預(yù)染處理就可以肉眼識別，也不需要進行改造去識別二抗，就可以熒光掃描。如果標(biāo)記信號是熒光，僅僅使用熒光掃描儀就可以將Marker和目標(biāo)蛋白顯示在同一張張片上；如果使用ECL發(fā)光液，按道理也能用熒光掃描儀就可以將Marker和目標(biāo)蛋白顯示在同一張照片上，只是熒光蛋白需要激發(fā)后才可以產(chǎn)生熒光，而ECL發(fā)光屬于化學(xué)發(fā)光，是通過化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生熒光。
方案三：將熒光蛋白（帶顏色的熒光蛋白，例如藻紅蛋白、藻藍蛋白、別 藻藍蛋白、綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白等，代替預(yù)染）與識別抗體IgG的proteinA、proteinG或 ProteinL，以及能被二抗結(jié)合的兔源或鼠源抗體Fc區(qū)基因融合表達，由于熒光蛋白自帶顏色，肉眼就可以判斷轉(zhuǎn)膜效率；同時，熒光蛋白 marker中的蛋白可以識別不同來源的一抗或二抗，能和目標(biāo)蛋白一起曝光顯示在一張照片上，實現(xiàn)了熒光蛋白Marker既是自預(yù)染蛋白（自帶顏色）又是曝光蛋白。由于熒光蛋白Marker沒有進行化學(xué)修飾，確保了蛋白分子量準(zhǔn)確，也不會影響電泳遷移變化和與膜的吸附能力。此外，在進行Western檢測時，不需要加入額外抗體試劑，也不需要使用集成多種檢測器的特殊設(shè)備，實驗室常規(guī)WB檢測設(shè)備就可以勝任。
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