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核酸提取試劑盒的工作原理

 更新時(shí)間:2023-02-06 點(diǎn)擊量:1107
核酸提取試劑盒的工作原理

子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中 qPCR、分子克隆、下一代測(cè)序等都需要進(jìn)行DNA提取。 

  如今,大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都使用商業(yè) DNA 提取試劑盒,這些試劑盒使用硅膠自旋過(guò)濾法來(lái)獲得高質(zhì)量的 DNA。這些可以快速有效地純化 DNA(或 RNA),在這里需要先了解一下DNA 提取試劑盒的工作原理。

核酸提取試劑盒的工作原理

離心柱包含一種硅膠樹脂,可根據(jù)鹽條件和受提取方法影響的其他因素選擇性地結(jié)合 DNA 和 RNA。這些 DNA 提取試劑盒使整個(gè)過(guò)程比舊的 DNA 分離方法更容易、更快。但是,使用套件的缺點(diǎn)是,如果您不了解套件的黑匣子中的內(nèi)容,則會(huì)使故障排除變得更加困難。

RNA和DNA提取

裂解:裂解公式可能因您要提取 DNA 還是 RNA 而異,但共同點(diǎn)是含有高濃度離液鹽的裂解緩沖液。
Chaotropes(離液劑)的作用:Chaotrope會(huì)破壞氫鍵及疏水間的相互作用。離液鹽包括鹽酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸鋰。
洗滌劑:除了離液劑外,裂解緩沖液中通常還有一些去污劑,以幫助蛋白質(zhì)溶解和裂解。
溶菌酶和蛋白酶K:根據(jù)樣品類型,也可以使用酶進(jìn)行裂解。蛋白酶 K 就是其中之一,實(shí)際上在這些變性緩沖液中效果較好;當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)變性增多,蛋白酶 K 的作用也會(huì)相應(yīng)增強(qiáng)。然而,溶菌酶在變性中不起作用,因此溶菌酶處理通常在添加變性鹽之前進(jìn)行。

關(guān)于質(zhì)粒制備的注意事項(xiàng)

分離質(zhì)粒 DNA 與提取 RNA 或基因組 DNA 的提取方式是不相同的,因?yàn)楸仨氋|(zhì)粒與基因組 DNA 必須分離。如果此刻,您加入離液劑將立即釋放所有物質(zhì),并且無(wú)法將小環(huán)狀 DNA 與高分子量染色體區(qū)別開來(lái)。因此,在質(zhì)粒制備過(guò)程中中,直到裂解后才加入離液劑,鹽用于結(jié)合。

DNA 提取后純化:將 DNA 與色譜柱結(jié)合

離液鹽對(duì)于裂解至關(guān)重要,而且對(duì)于將 DNA(或 RNA)與色譜柱結(jié)合也是如此。此外,為了增強(qiáng)和影響核酸與二氧化硅的結(jié)合,還添加了酒精。
大多數(shù)情況下這是乙醇,但有時(shí)可能是異丙醇。乙醇百分比和體積有很大的影響。太多,你會(huì)帶入大量降解的核酸和小物種,這會(huì)影響 A260 讀數(shù)并降低你的一些產(chǎn)量。太少,可能難以從膜上洗掉所有鹽分。
如果您在裂解中使用含有 SDS 的去污劑,請(qǐng)嘗試使用NaCl 作為沉淀劑,以避免去污劑污染 DNA 或 RNA。

洗滌 DNA(或 RNA)

當(dāng)裂解物通過(guò)硅膠膜進(jìn)行離心分離,現(xiàn)在所提取的 DNA 或 RNA 應(yīng)該與柱子結(jié)合,雜質(zhì)、細(xì)胞蛋白和多糖應(yīng)該已經(jīng)通過(guò)了。 
但是,膜仍然被殘留的細(xì)胞蛋白質(zhì)和鹽弄臟。如果樣品來(lái)自植物,仍然會(huì)有多糖,也許一些色素留在膜上,或者如果樣品是血液,膜可能會(huì)被染成棕色或黃色。

通過(guò)洗滌的方法去除雜質(zhì)


通常有兩次洗滌,盡管這可能因樣品類型而異。初次洗滌通常會(huì)含有少量的離液鹽,以去除蛋白質(zhì)和有色污染物。 這之后總是用乙醇洗滌以除去鹽。
如果開始的準(zhǔn)備工作沒有大量蛋白質(zhì),例如質(zhì)粒準(zhǔn)備或 PCR 清理,則只需要乙醇洗滌。去除離液鹽對(duì)于獲得高產(chǎn)量和高純度的 DNA 或 RNA 至關(guān)重要。一些試劑盒甚至?xí)靡掖记逑粗觾纱巍?/span>
如果殘留鹽分,核酸的洗脫會(huì)很差,A230讀數(shù)會(huì)很高,導(dǎo)致260/230的比率很低。對(duì)于無(wú)乙醇 DNA 和 RNA,需要進(jìn)行干法離心,乙醇洗滌后,大多數(shù)方案都有一個(gè)離心步驟來(lái)干燥柱子。這是為了去除乙醇,對(duì)于清潔的洗脫液是必要的。 
當(dāng)將 10 mM Tris 緩沖液或水應(yīng)用于膜進(jìn)行洗脫時(shí),核酸會(huì)水合并從膜中釋放出來(lái)。如果色譜柱上仍有乙醇,則核酸無(wú)法再與水融合。如果跳過(guò)干燥步驟會(huì)導(dǎo)致乙醇污染和低產(chǎn)量。很可能在 Nanodrop 上看不到乙醇吸光度,所以它不會(huì)出現(xiàn)在您的讀數(shù)中。

RNA 和 DNA 提取:洗脫法

DNA 提取方案的還剩余IDE步驟步就是從硅膠中釋放純 DNA 或 RNA。
  對(duì)于 DNA 制備,通常使用 pH 值為 8-9 的 10 mM Tris。DNA 在弱堿性 pH 值下更穩(wěn)定,在緩沖液中溶解得更快。即使對(duì)于 DNA 顆粒也是如此。水的 pH 值往往較低,低至 4-5,并且高分子量 DNA 在用于洗脫的短時(shí)間內(nèi)可能無(wú)法再與水結(jié)合。
通過(guò)在離心前讓緩沖液在膜中停留幾分鐘,可以較大限度地洗脫 DNA。
由于RNA 易溶于水,且RNA 利于處在微酸性的 pH 值環(huán)境下。
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