隨著藥物靶點復雜性的增加，哺乳動物細胞系統(tǒng)中的基因重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)變得越來越普遍。通過瞬時轉染的方式 適當?shù)?/span>進行蛋白質(zhì)的折疊、組裝和翻譯后修飾對于哺乳動物細胞表達也具有重要的意義 。
源自 CHO 和 HEK 293 細胞的懸浮細胞系通常用于哺乳動物蛋白質(zhì)生產(chǎn)。這些細胞系具有許多理想的特性，包括高表達水平、可擴展性（密度和體積）等等。
部分基因藥物會使用穩(wěn)定的轉染劑，以實現(xiàn)批次間的一致性和大規(guī)模的低成本。在過去十年中的細胞轉染方面也有著許多進展，瞬時轉染方法在改進的細胞系、表達載體、培養(yǎng)基和遞送方法、哺乳動物蛋白表達等方面也被廣泛使用。
在許多藥物發(fā)現(xiàn)應用中，使用瞬時轉染方法快速篩選蛋白質(zhì)構建體是有益的，因為它可以同時評估各種靶分子或蛋白質(zhì)亞型。在多數(shù)情況下，瞬時轉染是并行進行的，而更多資源密集型的穩(wěn)定細胞系也正在開發(fā)中。
轉染技術的使用穩(wěn)定的轉染試劑盒 ，可以提高懸浮 CHO 和 293 衍生細胞中的抗體蛋白滴度。比如：使用 Mirus Bio 的技術，通過添加質(zhì)粒 DNA、Trans IT-PRO 轉染試劑和 PRO Boost 試劑在無血清培養(yǎng)基中制備轉染復合物。
將復合物孵育 10-30 分鐘后，可以將它們直接添加到正常生長培養(yǎng)基中的細胞中。使用快速轉染試劑盒進行轉染，無需在轉染后更換培養(yǎng)基，適用于瞬時轉染和穩(wěn)定轉染。對于分泌型抗體構建體，通常在分批發(fā)酵轉染后 5-7 天獲得Max滴度。
在優(yōu)化瞬時轉染方案期間應當考慮以下幾個參數(shù)，主要包括：轉染時的細胞密度、DNA 濃度、試劑與 DNA 的比率和細胞培養(yǎng)基。
1.細胞密度
在任何組織培養(yǎng)實驗之前，細胞健康是一個重要的考慮因素。理想情況下，細胞應具有一致的倍增時間和高活力。細菌、酵母菌、病毒或支原體的污染不僅會損害細胞健康，還會降低轉染效率。
對于可以生長到較高密度的懸浮細胞，在轉染時優(yōu)化細胞密度尤其重要。當細胞在轉染過程中積極分裂時效率為Max值，這有助于質(zhì)粒DNA 進入細胞核。圖 1顯示了 CHO 懸浮細胞密度的滴定，范圍為 0.25 x 10 6 –2.0 x 10 6 個細胞/mL。在轉染時，在 0.5 x 10 6 –1.0 x 10 6 個細胞/mL之間的細胞密度下檢測到最大數(shù)量的 GFP 表達細胞（約 60%） 。
圖 1. 轉染時的最佳細胞密度為 0.5 x 10 6 –1.0 x 10 6 個細胞/mL。CHO-S 細胞在轉染時使用Trans IT-PRO 轉染試劑盒以一定范圍的細胞密度轉染。使用增強型綠色熒光蛋白 (EGFP) 報告質(zhì)粒，使用 1:1:1 比例的反式 IT-PRO:Boost 試劑:DNA 形成復合物。使用流式細胞術在轉染后 48 小時確定 GFP 轉染效率。使用在 FreeStyle CHO 表達培養(yǎng)基（2 mL/孔）中培養(yǎng)的 FreeStyle™ CHO-S 細胞在 24 孔深孔搖床中進行轉染。誤差棒代表一式三份孔的標準偏差。
2.DNA濃度
在某些細胞類型中，增加質(zhì)粒 DNA 濃度也會提升轉染效率，提高基因表達。然而， DNA 的濃度如果過高，會使成本增加或者產(chǎn)生毒性。圖 2使用三種不同劑量的Trans IT-PRO 和 PRO Boost 試劑檢查了每毫升培養(yǎng)物 0.25–3.0 µg 的一系列質(zhì)粒 DNA 濃度。通常，每毫升培養(yǎng)物中 1.0–1.5 µg DNA ,是細胞表達的Max濃度。
圖 2. 使用Trans IT-PRO 轉染試劑盒滴定 DNA 濃度和試劑與 DNA 的比率。在不同的質(zhì)粒濃度 (0.25–3.0 µg/mL) 和使用三種不同比例的Trans IT-PRO:PRO Boost Reagent (0.5:0.5、1:1 和 2:2)/µg DNA 比較熒光素酶蛋白表達。使用在 BD Select CD1000 培養(yǎng)基（2 mL/孔）中培養(yǎng)的 FreeStyle CHO-S 細胞在 24 孔深孔搖床中進行轉染。細胞以 0.5 x 10 6 個細胞/mL的密度鋪板，轉染后 48 小時收獲，并使用常規(guī)熒光素酶測定法進行測定。誤差棒代表一式三份孔的標準偏差。
2.試劑濃度
試劑與 DNA 的比率也是瞬時轉染中影響細胞轉染速度的主要參數(shù)。如果試劑量不足或過量都會阻礙 DNA 遞送。這是由于陽離子轉染試劑和帶負電的質(zhì)粒 DNA 之間的靜電相互作用促進了轉染復合物的質(zhì)膜結合和內(nèi)化。然而，過多的正電荷通常與細胞毒性有關，因此需要滴定轉染試劑與 DNA 的比率以確定峰值蛋白質(zhì)的表達。
圖 2比較了三種不同水平的Trans IT-PRO 和 PRO Boost Reagent（每 µg DNA 0.5 µL–2.0 µL）；使用濃度為每 1.0 µg DNA 各 1.0 µL 的Trans IT-PRO 和 PRO Boost 試劑可獲得Max的熒光素酶表達。
3.培養(yǎng)基試劑配方
轉染效率受培養(yǎng)生長培養(yǎng)基的影響，并且有許多市售的無血清生長培養(yǎng)基用于生物功能型蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。由于這些培養(yǎng)基配方是專有的，因此可能需要測試幾種培養(yǎng)基配方以找到與所需轉染方法互補的一種。
圖 3顯示了懸浮 CHO 細胞，它們已適應五種不同的培養(yǎng)基配方。使用多種轉染方法，包括： Trans IT-PRO 轉染試劑盒、試劑 P 和試劑 F（圖 3） ，用編碼人 IgG1 抗體構建體的質(zhì)粒轉染適應相應培養(yǎng)基的細胞。
在給定的轉染方法中，分泌的抗體滴度變化超過 10 倍，具體取決于培養(yǎng)基類型。此外，并非所有轉染技術都表現(xiàn)出廣譜培養(yǎng)基兼容性。
懸浮 CHO 衍生細胞的瞬時轉染效率直接關系到靶向藥物的研發(fā)和生產(chǎn)。值得注意的是，蛋白質(zhì)產(chǎn)量嚴重依賴于重組蛋白質(zhì)的內(nèi)在特性。相同亞型的兩種抗體構建體可以產(chǎn)生截然不同的蛋白質(zhì)滴度。比較兩種或多種轉染方法時，請在同一天使用相同的質(zhì)粒 DNA 構建體和相同批次的細胞進行轉染。這允許小化細胞和實驗變量。
Trans IT-PRO 轉染試劑盒等新轉染方法使研究人員能夠以直接一致的方式獲得更高的蛋白質(zhì)滴度。關鍵轉染參數(shù)的進一步優(yōu)化使研究人員能夠獲得高轉染效率和足夠的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，以加速藥物發(fā)現(xiàn)。
圖 3. 蛋白質(zhì)產(chǎn)量取決于培養(yǎng)基配方和轉染方法。FreeStyle CHO-S 細胞適應五種代表性生長培養(yǎng)基。使用Trans IT-PRO 和 PRO Boost Reagent (1:1:1)、Reagent P (4:1) 或 Reagent F (1:1) 轉染試劑轉染細胞。在 24 孔深孔搖床塊中進行轉染，每毫升培養(yǎng)物中使用 1 µg DNA，轉染時使用 0.5 x 10 6 個細胞/mL。從第 5 天澄清的上清液對人 IgG1 進行定量，并通過標準夾心 ELISA 進行分析。誤差棒代表一式三份孔的
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