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熒光素酶檢測時的注意事項

 更新時間:2022-06-15 點擊量:1260

標簽:熒光素 細胞轉(zhuǎn)染 熒光強度   熒光檢測 啟動子 

  螢火蟲可以在螢光素酶的存在下將螢光素轉(zhuǎn)化為氧化螢光素以發(fā)光。利用熒光素酶的較常見的科學(xué)測定是報告基因測定,其中可以通過測量來自熒光素酶反應(yīng)的光信號來跟蹤轉(zhuǎn)錄激活或抑制。建議使用雙熒光素酶系統(tǒng),其中發(fā)生二次生物發(fā)光反應(yīng)。第二個信號由另一個分子發(fā)出。最常見的是由也可以生物發(fā)光的海腎基因編碼(一些質(zhì)粒已經(jīng)包含海腎和螢光素酶基因,例如 Promega 的 pmirGLO)。這允許您將熒光素酶表達標準化為對照并測量您的相對轉(zhuǎn)染效率。


熒光素酶檢測過程中的注意事項
1.信號問題:無信號或低信號。
    這可能歸于轉(zhuǎn)染問題。我會先檢查你的質(zhì)粒的質(zhì)量。確保您具有轉(zhuǎn)染質(zhì)量的 DNA正常的小量制備柱通常會攜帶更多的內(nèi)毒素和鹽,這些內(nèi)毒素和鹽可能會抑制您的細胞轉(zhuǎn)染或?qū)е录毎劳觥?/span>
    有些細胞難以轉(zhuǎn)染。建議對使用的每個細胞系,對 DNA 和轉(zhuǎn)染試劑的量進行滴定實驗。顯然,作為您的標準化對照,使用的海腎質(zhì)粒的量應(yīng)始終保持不變。
2.DNA 量:通常您要評估對照質(zhì)粒與實驗質(zhì)粒,由于添加了實驗序列,這些質(zhì)粒的大小可能不同。即使您將相同量的 DNA 轉(zhuǎn)染到每個孔中,每個孔獲得的 DNA 總量也可能不同,因為您轉(zhuǎn)染的摩爾比不同。
例如:
來自 2000 bp 質(zhì)粒的 1 µg DNA 是 0.76 pmoles DNA
來自 3000 bp 質(zhì)粒的 1 µg DNA 是 0.51 pmoles DNA。
較大的質(zhì)粒每克含有較少的 DNA 摩爾數(shù)!因此,您需要轉(zhuǎn)染更大質(zhì)粒的更多 DNA,才能轉(zhuǎn)染與小質(zhì)粒相同數(shù)量的 DNA。為了使轉(zhuǎn)染的 DNA 量標準化,許多人使用“填充"DNA,例如 pUC19 質(zhì)粒(在哺乳動物細胞中沒有功能)。
例如,要測試不同數(shù)量的熒光素酶質(zhì)粒但保持總 DNA 相同,您可以執(zhí)行以下操作:

3.時間:您可能錯過了可視化效果的窗口。細胞通常在轉(zhuǎn)染后 24 – 48 小時進行檢測,但這在很大程度上取決于細胞機器表達您感興趣的基因所需的時間??梢砸詢?yōu)化轉(zhuǎn)染后孵育時間的時間過程來決定檢測細胞的合適時間點。
4.信號太強:飽和度:雖然高的信號可能被視為陽性,但您還需要確保您處于檢測和光度計的動態(tài)范圍內(nèi),并且不會使信號飽和。如果您有較高的值,則您可能使用了過多的 DNA。
啟動子強度:此外,您可能需要更改質(zhì)粒。如果您使用非常強的啟動子,例如 CMV 或 SV40,這也可能會使您的信號飽和。某些應(yīng)用(例如,如果您正在測量 miRNA 阻斷結(jié)合位點的能力)需要較弱的啟動子,因為您所看到的效果可能比轉(zhuǎn)錄阻遏元件的效果非常輕微。

重復(fù)之間的差異:
同一實驗的孔之間的差異表現(xiàn)在:
1.移液:孔獲得的液體量的微小變化會極大地影響轉(zhuǎn)染和熒光素酶測定的執(zhí)行方式。熒光素酶檢測對此較為敏感!建議為您的轉(zhuǎn)染反應(yīng)制作預(yù)混液(即使它只是用于重復(fù)的 3 個孔)。對于每個組合,您應(yīng)該始終至少有 2 次重復(fù),最好是 3 次。
2.酶標板:另一個問題可能是你的酶標板。來自相鄰孔的背景發(fā)光會干擾您的實驗。建議您在白壁或不透明板中進行熒光素酶檢測。但是,您無法在白色孔板中看到您的細胞,因為它們是*白色的!
3.實驗之間的變異(生物變異)
    應(yīng)該重復(fù)多次實驗,以確保您測量的效果是可重復(fù)的,因此有可能與生物學(xué)相關(guān)。然而,我們注意到細胞進行轉(zhuǎn)染的能力在很大程度上取決于它們的匯合度,尤其是貼壁細胞。轉(zhuǎn)染依賴于細胞表面接觸,過度融合的細胞可能轉(zhuǎn)染效率較低。不要假設(shè)如果您接種相同數(shù)量的細胞,它們每次都會以相同的方式沉淀在板的底部!從而致使細胞結(jié)塊。嚴重地影響您細胞的轉(zhuǎn)染效率和熒光素酶的檢測結(jié)果。