聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種在生物分子領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù)。Taq DNA聚合酶作為PCR反應(yīng)中的關(guān)鍵酶,其性能直接影響著實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本文主要介紹了Taq DNA聚合酶的來源、特性、活性定義及質(zhì)量控制方法,并探討了Taq DNA聚合酶在PCR反應(yīng)中的使用方法及優(yōu)化策略。
一、Taq DNA聚合酶的來源與特性
Taq DNA聚合酶是一種來源于嗜熱菌Thermus aquaticus的耐熱性DNA聚合酶,通過大腸桿菌重組表達純化獲得。該酶分子量為94kDa,與天然Taq DNA聚合酶具有相同的功能。Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性,但無3'→5'外切酶活性。這使得PCR產(chǎn)物的3'端帶有突出的A堿基,便于克隆至T載體。
二、Taq DNA聚合酶的活性定義及質(zhì)量控制
1. 活性定義:1個活性單位(U)定義為在74℃下,30分鐘內(nèi)催化10 nmol dNTP摻入酸不溶物所需的酶量。
2. 質(zhì)量控制:Taq DNA聚合酶的蛋白純度通過SDS-PAGE凝膠電泳檢測,純度不低于95%。此外,還需進行以下檢測:
(1)核酸內(nèi)切酶活性檢測:將5 U Taq DNA Polymerase與200 ng超螺旋質(zhì)粒DNA在37℃下共同溫育4小時,使用瓊脂糖凝膠電泳檢測,少于10%的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)變成缺刻或線性狀態(tài)。
(2)非特異性核酸酶活性檢測:將5 U Taq DNA Polymerase與15 ng雙鏈DNA片段在37℃溫育16小時,使用瓊脂糖凝膠電泳檢測雙鏈DNA底物無變化。
(3)宿主DNA殘留檢測:使用大腸桿菌16S rDNA特異性引物探針組,采用熒光定量PCR法檢測5 U Taq DNA Polymerase,大腸桿菌宿主基因組DNA殘留低于1 copy。
三、Taq DNA聚合酶在PCR反應(yīng)中的使用方法及優(yōu)化策略
1. 使用方法:
(1)建議的PCR反應(yīng)體系:以50 μl體系為例,Taq DNA Polymerase(5 U/μl)0.25 μl,10×Taq Reaction Buffer 5 μl,dNTP(10 mM)1 μl,正向引物(10 μM)1 μl,反向引物(10 μM)1 μl,模板DNA x μl,ddH2O補至50 μl。
(2)常規(guī)PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性94℃ 3~5分鐘,變性94℃ 30秒,退火55~65℃ 30秒,延伸72℃ 30~60秒/kb,終延伸72℃ 5分鐘。
2. 優(yōu)化策略:
(1)引物設(shè)計:引物長度建議設(shè)定為18~25 bp,GC含量為40%~60%。引物終濃度推薦為0.2 μM,效果不佳時可以在0.1~1 μM進行調(diào)整。
(2)模板濃度:不同模板最佳反應(yīng)濃度有所不同。以基因組DNA為模板時,一般使用量應(yīng)在10~400 ng;當(dāng)模板為質(zhì)粒或病毒DNA時,一般使用量應(yīng)在10 pg~20 ng。
(3)預(yù)變性條件:對于一些復(fù)雜模板,如菌液、菌落(尤其是酵母)的PCR擴增,預(yù)變性時間可適當(dāng)延長至10分鐘,以提高預(yù)變性效果。
(4)目的片段長度:使用酵母菌液作為PCR擴增模板時,建議目的片段長度不超過2.5 kb;若超出2.5 kb,建議將酵母菌液預(yù)先進處理。
百時美的 Taq DNA Polymerase為來源于嗜熱菌Thermus aquaticus,經(jīng)大腸桿菌重組表達純化獲得的耐熱性DNA聚合酶,分子量為 94 kDa,與天然Taq DNA 聚合酶具有相同的功能。該酶具有 5'→ 3' 聚 合酶活性和 5'→3' 外切酶活性,但無3'→ 5'外切酶活性。PCR 產(chǎn)物的3' 端帶有突出的 A 堿基,可克隆至 T 載體。
總之,Taq DNA聚合酶在PCR技術(shù)中具有重要作用。通過了解其特性、活性定義及質(zhì)量控制方法,合理優(yōu)化PCR反應(yīng)體系及程序,可以提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在實際應(yīng)用中,根據(jù)不同實驗需求,對Taq DNA聚合酶進行優(yōu)化,有助于提高PCR技術(shù)的應(yīng)用效果。
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