[實(shí)驗(yàn)原理]
當(dāng)細(xì)胞置于非常高的電場(chǎng)中，細(xì)胞膜就變得具有通透性，能讓外界的分子擴(kuò)散進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，這一現(xiàn)象稱(chēng)為電穿孔。運(yùn)用這一技術(shù)，許多物質(zhì)，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、藥物、抗體和熒光探針都能載入細(xì)胞。作為一種基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，電穿孔已被廣泛用于各種細(xì)胞類(lèi)型，包括細(xì)菌、酵母、植物和動(dòng)物細(xì)胞；而且，它還能作為注射方法（稱(chēng)為電注射），把各種外源物質(zhì)引入活細(xì)胞。與其他常用的導(dǎo)入外源物質(zhì)的方法相比，電穿孔具有很多優(yōu)點(diǎn)。
一.不必象顯微鏡那樣使用玻璃針，不需要技術(shù)培訓(xùn)和昂貴的設(shè)備，可以一次對(duì)成百萬(wàn)的細(xì)胞進(jìn)行注射。
二.與用化學(xué)物質(zhì)相比，電穿孔幾乎沒(méi)有生物或化學(xué)副作用。
三.因?yàn)殡姶┛资且环N物理方法，較少依賴(lài)細(xì)胞類(lèi)型，因而應(yīng)用廣泛。實(shí)際上，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型，用電穿孔法基因的轉(zhuǎn)移效率比化學(xué)方法高得多。
除了能使細(xì)胞膜具有通透性，讓外界的分子擴(kuò)散入胞液中以外，高強(qiáng)度的電場(chǎng)脈沖也能引起細(xì)胞融合，這一現(xiàn)象叫做電融合。然而，在用電脈沖融合前必須使細(xì)胞相互緊密接觸，這一電融合方法在原生質(zhì)融合制取雜交植物，胚胎細(xì)胞相互融合制備動(dòng)物克隆方面非常有用，尤其在制取雜交瘤細(xì)胞制備單克隆抗體方面用處很大。幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室已證明使用電場(chǎng)電融合效率比常規(guī)的化學(xué)融合方法高10到100倍，最近，貼壁細(xì)胞的電融合還被用來(lái)研究細(xì)胞融合時(shí)細(xì)胞的骨架成分和細(xì)胞器的動(dòng)力學(xué)重排。
[儀器、材料和試劑]
（一）儀器：
脈沖發(fā)生器，樣品池：一個(gè)盛細(xì)胞的容器和兩個(gè)平行的金屬電極，CO2培養(yǎng)箱，離心機(jī)，顯微鏡，微量移液器，鑷子，剪刀，三角瓶，吸管，毛細(xì)管，離心管等。
（二）材料：
（三）試劑：
穿孔介質(zhì)（PM）：15mmol/L磷酸鉀 1mmol/L MgCl2 250mmol/L蔗糖（或甘露醇） 10mmol/L HEPES 調(diào)節(jié)pH至7.3
融合介質(zhì)（FM）：1mmol/L MgCl2 280mmol/L甘露醇 2mmol/L HEPES 調(diào)節(jié)pH至7.3
[方法與步驟]
一．懸浮細(xì)胞的電穿孔法：
1電穿孔進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移
電穿孔可用于將多種不同類(lèi)型的分子載入活細(xì)胞中，操作步驟非常相似。以下我們用基因轉(zhuǎn)移作為例子。載入其他的分子可按以下相同步驟進(jìn)行，只需把外源DNA換頁(yè)所需分子即可。
1.1 使細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，用胰酶處理，收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的細(xì)胞，并用腺酶處理。
1.2 在穿孔介質(zhì)（PM）中至少洗一次。洗細(xì)胞時(shí)，在臺(tái)式離心機(jī)上1000rpm離心3分鐘，使得懸浮細(xì)胞沉降。然后，去掉上清液，在新的介質(zhì)中重新懸浮細(xì)胞。
1.3 計(jì)數(shù)細(xì)胞，在PM中，濃縮細(xì)胞為大約1千萬(wàn)細(xì)胞/ml。
1.4 將DNA加到細(xì)胞懸液中，充分混合，使DNA均勻分散，用吸管吸一定體積的細(xì)胞-DNA混合液到裝有電極的滅菌小樣品池中。
1.5 在電穿孔裝置上設(shè)置輸出電壓和脈沖寬度（脈沖寬度是指數(shù)衰減函數(shù)的時(shí)間常數(shù)，即τ=RC，C是電容，R是樣品的電阻）。假如設(shè)備是CD脈沖型發(fā)生器，設(shè)定電容和并聯(lián)電阻，以達(dá)到合適的τ值。
1.6 將小池放進(jìn)盛樣品的池中，啟動(dòng)電穿孔裝置，供給所需的電脈沖。
1.7 電處理后，向小池加1ml普通培養(yǎng)基，將細(xì)胞混合液從小池轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)容器（培養(yǎng)皿或培養(yǎng)孔）中，再加入一些培養(yǎng)基使最終的培養(yǎng)基體積適量。然后，將樣品細(xì)胞放回孵育箱中使之在正常條件下生長(zhǎng)。
1.8 在測(cè)定轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)量前電穿孔細(xì)胞各自培養(yǎng)的時(shí)間不同。
2檢測(cè)電穿孔效率和細(xì)胞存活率
2.1 除用羅丹明偶聯(lián)葡聚糖（1mg/ml）（分子探針）代替DNA外，將羅丹明偶聯(lián)葡聚糖引入目標(biāo)細(xì)胞的方法如前所述。
2.2 電穿孔后，用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，去掉胞外的熒光葡聚糖。
2.3 電穿孔后30min，向細(xì)胞懸液中加30μl臺(tái)盼藍(lán)，孵育2min，然后用培養(yǎng)基洗滌。
2.4 在1000rpm下離心3min，收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于PM中，終體積100μl。
2.5 將一滴細(xì)胞液（30μl）置于干凈載玻片上，用蓋玻片蓋好，在顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞，測(cè)定攝取熒光標(biāo)記葡聚糖的百分?jǐn)?shù)。
2.6 在亮視野鏡片下，死細(xì)胞可因染成藍(lán)色檢測(cè)出（攝取了臺(tái)盼藍(lán)），測(cè)定細(xì)胞存活的百分?jǐn)?shù)。
2.7 在各種電場(chǎng)設(shè)定值下重復(fù)實(shí)驗(yàn)，畫(huà)出攝取葡聚糖率和細(xì)胞存活率對(duì)電穿孔參數(shù)的曲線。這一曲線就將顯示對(duì)特定細(xì)胞類(lèi)型電穿孔的合適條件。
