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細胞轉(zhuǎn)染方法之-磷酸鈣沉淀法

 更新時間:2024-04-29 點擊量:316

【實 驗 原 理】

磷酸鈣沉淀法是基于磷酸鈣-DNA復合物的一種將DNA導入真核細胞的轉(zhuǎn)染方法。磷酸鈣有利于促進外源DNA與靶細胞表面的結合。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲作用進入靶細胞,被轉(zhuǎn)染的DNA可以在細胞內(nèi)進行瞬時表達,也可整合到靶細胞的染色體上從而產(chǎn)生不同基因型和表型的穩(wěn)定克隆。該方法可廣泛用于轉(zhuǎn)染許多不同類型的細胞。


細胞轉(zhuǎn)染試劑


【儀器、材料和試劑】

(一)儀器、用具

CO2培養(yǎng)箱[1]、10cm細胞培養(yǎng)平板、巴斯德吸管、微量移液器[2]、15ml錐形管、燒杯、量筒等。

(二)材料

呈指數(shù)生長的真核細胞BALB/c 3T3

CsCl純化的表達質(zhì)粒DNA

(三)試劑

1.培養(yǎng)基

DMEM 90ml

FCS 10ml

2.2M CaCl2,過濾除菌,-20℃保存?zhèn)溆?/p>

3.2×HEBS (g/500ml)

NaCl 8.0

KCl 0.38

Na2HPO4.7H2O 0.19

HEPES 5.0

葡萄糖 1.0

用NaOH調(diào)pH至6.95,過濾除菌后,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>


細胞培養(yǎng)系統(tǒng)


【方法與步驟】

1.在10cm的培養(yǎng)板上接種1×106個BALB/c 3T3細胞

第二天進行轉(zhuǎn)染

2.準備CaPO4沉淀

2.1 準備兩組試管

在A管中加入: 15μg質(zhì)粒DNA

69μl 2M CaCl2

460μl重蒸水

在B管中加入: 550μl 2×HEBS

2.2 用巴斯德吸管將A管中的溶液緩慢地逐滴加入在B管中,同時用另一吸管吹打B管溶液,整個過程需緩慢進行,至少需持續(xù)1~2min。

2.3室溫靜置30min,出現(xiàn)細小顆粒沉淀。

3. 小心地將沉淀逐滴均勻地加入培養(yǎng)細胞的10cm平板中,輕輕晃動(此過程需盡快完成)。

4. 在5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞2-6 hr。

5. 除去培養(yǎng)液,加入10ml培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞1-6天(依具體情況而定)。

6. 收集細胞進行基因活性的檢測,或分散接種到其他培養(yǎng)皿中進行選擇培養(yǎng)。


細胞轉(zhuǎn)染試劑


【注 意 事 項】

1.在整個轉(zhuǎn)染過程中要保持無菌操作。

2.在實驗中使用的各種試劑都必須小心校準,保證質(zhì)量。

3.質(zhì)粒DNA 需CsCl純化,乙醇沉淀后的DNA應保持無菌,在無菌水或Tris- EDTA中溶解。

4.沉淀物的大小和質(zhì)量對于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關重要。在磷酸鹽溶液中加入DNA-CaCl2溶液時需用空氣吹打,以確保形成盡可能細小的沉淀物,因為成團的DNA不能有效地黏附和進入細胞。

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