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蛋白純化標(biāo)簽選購(gòu)技巧

 更新時(shí)間:2024-04-26 點(diǎn)擊量:278

體外重組蛋白表達(dá)技術(shù)已經(jīng)滲透到生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。目前,體外重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)主要有四類:原核表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)、酵母表達(dá)系統(tǒng)及昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)。表達(dá)的一般實(shí)驗(yàn)包括載體構(gòu)建-表達(dá)鑒定-蛋白純化三大步驟。在構(gòu)建載體階段,除了一些必要的表達(dá)元件,還需要考慮的密碼子優(yōu)化和標(biāo)簽的選擇。選擇合適的標(biāo)簽不但有利于蛋白的純化,促進(jìn)蛋白的可溶性,同時(shí)也不能影響蛋白的結(jié)構(gòu)功能和下游應(yīng)用。本文詳細(xì)介紹了幾種蛋白純化標(biāo)簽,幫助我們更好的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。

一,蛋白純化標(biāo)簽比較


蛋白純化標(biāo)簽

蛋白純化標(biāo)簽


二,HIS-Tag(組氨酸標(biāo)簽)

His標(biāo)簽主要用來(lái)融合表達(dá)的,其原因主要有:

1,HIS-Tag本身的特性對(duì)目的蛋白沒(méi)有影響,不會(huì)形成二聚體;

2,分子量較小,只有0.84KD,對(duì)蛋白的下游應(yīng)用不會(huì)產(chǎn)生影響;

3,免疫原性低,可將純化的蛋白直接注射動(dòng)物進(jìn)行免疫并制備抗體;

4,HIS-Tag與細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制兼容,有利于蛋白表達(dá);

5,可與其他標(biāo)簽構(gòu)建雙標(biāo)簽表達(dá),可用于多種蛋白表達(dá)系統(tǒng),純化條件溫和對(duì)蛋白影響較小。

蛋白純化


蛋白純化標(biāo)簽



HIS-Tag由6-10個(gè)組氨酸殘基組成,分子量不到0.84KD,通常插入在目的蛋白的C末端或N末端。HIS-Tag是目前原核表達(dá)常用的標(biāo)簽,蛋白純化完之后可以不需切除此標(biāo)簽,也不會(huì)對(duì)蛋白產(chǎn)生功能影響。同時(shí),蛋白純化步驟簡(jiǎn)便,純化條件溫和,對(duì)蛋白也不會(huì)產(chǎn)生太大影響。

三,GST-Tag(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽)

GST-Tag相對(duì)分子質(zhì)量較大,約為26KD,插入在目的蛋白的C末端或N末端,大腸桿菌中常用在N端。GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶) 蛋白本身是一個(gè)在解毒過(guò)程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶。一般選擇GST標(biāo)簽的目的有兩個(gè),一是提高蛋白表達(dá)的可溶性,二是提高蛋白的表達(dá)量。蛋白表達(dá)純化結(jié)束后需根據(jù)不同的蛋白應(yīng)用而確定是否切除標(biāo)簽,標(biāo)簽較大,切除與否需根據(jù)下游應(yīng)用考慮。如果要去除GST融合部分,可用位點(diǎn)特異性蛋白酶切除。檢測(cè)方法可用GST抗體或表達(dá)的目的蛋白特異性抗體檢測(cè)。

GST-Tag的優(yōu)缺點(diǎn)

1,增加外源蛋白的可溶性;

2,可在不同的宿主中表達(dá),適用范圍廣;

3,可用不同的蛋白酶可以方便去除;

4,很好保留了蛋白的抗原性和生物活性,提高外原蛋白的穩(wěn)定性;

5,高特異性,純化方便且溫和;

6,分子量較大,可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能和下游實(shí)驗(yàn);

7,如果蛋白不可溶,很難用變性的方法純化。

GST親和純化原理

GST 親和層析[1] 是利用GST 融合蛋白與固定的谷胱甘肽(GSH)通過(guò)硫鍵共價(jià)親和,通過(guò)GSH交換洗脫的原理來(lái)進(jìn)行純化 。該純化柱中,凝膠手臂上通過(guò)硫鍵結(jié)合一個(gè)谷胱甘肽。然后利用谷胱甘肽與谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(即GST-tag(26 KDa))之間酶和底物的特異性作用力,使得帶GST標(biāo)簽的融合蛋白能夠與凝膠上的手臂谷胱甘肽結(jié)合,從而將帶標(biāo)簽的蛋白與其他蛋白分離開(kāi)。谷胱甘肽通常有氧化型GSSG和還原型GSH,當(dāng)我們使用GSH洗脫時(shí),GSH會(huì)與凝膠上的谷胱甘肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合融合蛋白,從而將目標(biāo)蛋白洗脫。GST標(biāo)簽蛋白可直接從細(xì)菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione sepharose)親和樹(shù)脂進(jìn)行純化。GST標(biāo)簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫,因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會(huì)失去對(duì)谷胱甘肽樹(shù)脂的結(jié)合能力,因此不能在純化緩沖液中加入強(qiáng)變性劑如:鹽酸胍或尿素等。如果蛋白表達(dá)在包涵體中,可復(fù)性后再純化。此外要去除GST標(biāo)簽,可用位點(diǎn)特異性蛋白酶切除。

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四,MBP-Tag(麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽)

MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白maltose binding protein), 殘基數(shù)346,分子量42.5KDa,由大腸桿菌K12的malE基因編碼,構(gòu)建時(shí)刻放在N端,用來(lái)提高可溶性(尤其是真核蛋白)。MBP的折疊需要DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL-GeoES兩個(gè)分子伴侶系統(tǒng)的幫助,這可以使這些分子伴侶聚集到目的蛋白的附近幫助其正確折疊。另外,以標(biāo)簽蛋白形式存在的麥芽糖結(jié)合蛋白可以減少目的蛋白的降解,提高表達(dá)產(chǎn)物的水溶性,也為以后對(duì)目的蛋白的純化提供了基礎(chǔ)。麥芽糖結(jié)合蛋白能夠被多糖樹(shù)脂吸附,因此在過(guò)柱時(shí),能夠使融合蛋白與其它蛋白成份分離。

MBP標(biāo)簽的優(yōu)缺點(diǎn):

1,簡(jiǎn)單親和純化即可實(shí)現(xiàn);

2,增加蛋白表達(dá)量和蛋白穩(wěn)定性;

3,促進(jìn)蛋白的可溶性和正確折疊;

4,標(biāo)簽較大,對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)/功能會(huì)有一定影響。


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五,NusA-Tag(轉(zhuǎn)錄終止/抗終止蛋白標(biāo)簽)

NusA是大腸桿菌自身的一種蛋白,即轉(zhuǎn)錄抗終止因子,殘基數(shù),495,分子量:54.87KDa,由1999年Davia將NusA從4000種大腸桿菌蛋白庫(kù)中篩得。NusA不具有獨(dú)立的純化標(biāo)簽功能,所以要與其它標(biāo)簽(如His標(biāo)簽)聯(lián)用。利用原核表達(dá)時(shí),NusA標(biāo)簽可以明顯的提高蛋白的可溶性,例如含有NusA標(biāo)簽的人白介素-3 融合蛋白(NusA/hIL-3 )在37℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)幾乎全部可溶(97%),而當(dāng)其單獨(dú)表達(dá)或融合GST標(biāo)簽表達(dá)時(shí)都是包涵體形式。另外NusA標(biāo)簽還可以提高不溶性靶蛋白如牛生長(zhǎng)激素(bGH)、人干擾素-γ (hIFN-γ)的可溶性。來(lái)自草木犀根瘤菌(Rizobiummeliloti)的酪氨酸激酶因?yàn)榉肿恿看?超過(guò)54kDa)并且基因含有大量稀有密碼子,自身在大腸桿菌中無(wú)法過(guò)量表達(dá),但是與NusA融合后卻可以高效表達(dá)。

NusA的優(yōu)缺點(diǎn):

1,可以提高蛋白質(zhì)的溶解性,可選的標(biāo)簽有NusA,MBP,GST;

2,這些標(biāo)簽不能用專門的親和基質(zhì)純化,融合蛋白構(gòu)建時(shí)必須與可用于純化的小親和標(biāo)簽連用。尤其是當(dāng)NusA蛋白增加融合蛋白溶解性時(shí),一些在大腸桿菌中表達(dá)為不溶性的蛋白在與NusA在N端融合時(shí)則變成可溶。但是由于它的分子量較大,導(dǎo)致靶蛋白的得率相對(duì)降低;

3,NusA本身不具有獨(dú)立的純化標(biāo)簽功能,所以要與其它標(biāo)簽如His標(biāo)簽聯(lián)用;

4,NusA對(duì)蛋白下游應(yīng)用會(huì)有影響,如蛋白需進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析(晶體衍射或核磁共振)。

六,SUMO(小泛素相關(guān)修飾物)

    SUMO標(biāo)簽蛋白是一種小分子泛素相關(guān)修飾蛋白,是存在于真核生物中高度保守的參與蛋白質(zhì)小泛素化相關(guān)修飾的一類大蛋白。與GST、MBP或NusA相比,SUMO不僅可以作為重組蛋白表達(dá)的融合標(biāo)簽還具備分子伴侶的功能,能促進(jìn)蛋白的正確折疊,對(duì)熱和蛋白酶具有耐受性,更有助于保持目的蛋白的穩(wěn)定性。此外,SUMO標(biāo)簽有著與其配套的蛋白酶(專一性強(qiáng)),此蛋白酶識(shí)別的是SUMO的三級(jí)結(jié)構(gòu),切割的特異性高,不存在任何氨基酸的殘留,因此適用于重組蛋白表達(dá)。

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