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人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC培養(yǎng)技術(shù)

 更新時間:2023-09-27 點(diǎn)擊量:755

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的培養(yǎng)是一項(xiàng)重要的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。下面將詳細(xì)介紹HUVEC的培養(yǎng)步驟,并分享一些經(jīng)驗(yàn)。

1. 準(zhǔn)備工作:

   a. 15-20cm長的新生兒臍帶放入無菌的PBS溶液中儲存。

   b. 注意臍帶最多貯存24小時在4℃下,室溫下不超過6小時。

2. 洗滌臍帶:

   a. 使用一個鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中,用無菌的PBS溶液沖洗3-5次,直至污血沖洗干凈。

3. 消化臍帶:

   a. 用手術(shù)鉗夾緊臍帶下端,加入15ml的膠原酶(1mg/ml)室溫下消化15-20分鐘,并不時上下?lián)u動臍帶。

4. 收集消化液:

   a. 消化完后,將下端手術(shù)鉗松開,消化液流入一個50ml無菌離心管中,用無菌的PBS溶液沖洗臍帶2-3次。

5. 離心:

   a. 將收集液離心(2000轉(zhuǎn)/分)3分鐘。

6. 轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中:

   a. 倒去上清,加入10ml M199培養(yǎng)基(加入10U/mlbFGF),用彎管吹散細(xì)胞,將所有液體轉(zhuǎn)入一個用明膠包被好的培養(yǎng)瓶中,37℃培養(yǎng)。

   b. 在每個培養(yǎng)瓶中加入3-4ml無菌的1%明膠溶液,搖勻使得明膠溶液鋪滿瓶底,放入37℃孵育,最少2小時,用前將明膠溶液倒掉即可。明膠包被有利于細(xì)胞貼壁。

7. 培養(yǎng)細(xì)胞:

   a. 培養(yǎng)24小時后,倒掉培養(yǎng)基,并用無菌的PBS溶液清洗2-3次,洗掉紅細(xì)胞和死細(xì)胞,加入10ml新鮮的M199培養(yǎng)基。

8. 換培養(yǎng)基:

   a. 以后每2天換一次培養(yǎng)基(每次換掉2/3的培養(yǎng)基)。

9. 細(xì)胞生長:

   a. 一般培養(yǎng)5-7天,細(xì)胞可長滿至80-90%單層,這時可以進(jìn)行傳代。

10. 傳代:

    a. 倒掉培養(yǎng)基,用無菌的PBS溶液清洗2-3次,加入2-3ml消化液(0.25%胰酶+0.1%EDTA)消化細(xì)胞,在顯微鏡下觀察,一旦細(xì)胞變圓,即加入2-3倍有血清的DMEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

    b. 用彎管將細(xì)胞吹打下來,并將所消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個50ml無菌離心管中,2000轉(zhuǎn)/分,離心3分鐘。

    c. 倒掉上清,加入10ml新鮮培基,一般一瓶細(xì)胞可傳代3-4瓶。以后照此傳代培養(yǎng)。

11. 優(yōu)化培養(yǎng):

    a. 一般傳代2-3代(培養(yǎng)了20天左右)用于各種實(shí)驗(yàn)效果較好。

以上是人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的培養(yǎng)步驟,希望對你有所幫助。