3T3-L1 (小鼠胚胎成纖維細胞)是從3T3細胞（Swissalbino）中經(jīng)克隆分離得到的連續(xù)傳代的亞系。該細胞從快速分裂到匯合和接觸性抑制狀態(tài)經(jīng)歷了前脂肪細胞到脂肪樣細胞的轉變。該細胞鼠痘病毒陰性；可產(chǎn)生甘油三酯，高濃度血清可增強細胞內脂肪堆積?？捎糜谘芯刻悄虿?，肥胖癥等。
細胞名稱：小鼠胚胎成纖維(經(jīng)成脂分化驗證)
細胞簡稱：3T3-L1
產(chǎn)品貨號：TCM-C702
種屬來源：小鼠
組織來源：胚胎
細胞形態(tài)：成纖維細胞樣
生長特性：貼壁生長
培養(yǎng)體系：DMEM-H+10%CS（新生牛血清）+1%P/S
配套培養(yǎng)基貨號：TCM-G702
傳代比例：1:3-1:4，每2-3天換液一次
傳代周期：48-72 h
培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%CO?，溫度：37℃
凍存條件：60%基礎培養(yǎng)基+30%FBS+10%DMSO，液氮儲存推薦海星Hycyte® 一步凍存液（即用型、無血清、無需程序降溫）
3T3-L1細胞培養(yǎng)注意事項
細胞密度：細胞密度是影響3T3-L1細胞分化的重要因素，過低或過高的細胞密度都會影響分化效果；密度一般控制在90%的匯合度，如果太低，則會影響細胞生長和分化，如果太高，則會導致細胞死亡和分化受阻。
培養(yǎng)基：3T3-L1細胞最適宜的培養(yǎng)基是DMEM高糖+10%新生牛血清。
傳代：3T3-L1細胞的傳代次數(shù)應該控制在10次以內，否則會影響細胞的生長和分化。在進行傳代時，需要注意細胞的消化過程，細胞對胰酶比較敏感，添加胰酶后約1分鐘內細胞會脫落，因此消化時間的把控極其重要，同時避免過度打碎細胞團，以保證細胞的生長和分化能力。
3T3-L1細胞成脂誘導分化操作步驟
前脂肪細胞是一類同時具有增殖和分化為成熟脂肪細胞能力的前體細胞，此種前體細胞在不同的生長因子、激素等物質的作用下，經(jīng)歷有絲分裂克隆期、生長停滯期、進一步的克隆期、終末分化四個階段，細胞本身的成纖維狀態(tài)發(fā)生改變，通過胞質內甘油三脂聚集形成成熟脂肪細胞。誘導完成后，經(jīng)油紅O染色，就可以在鏡下觀察到甘油三脂脂肪滴的生成。
1.成脂誘導分化操作
1.1 接種干細胞取對數(shù)生長期3T3-L1的細胞，按照2.0×10^4cells/c㎡的細胞密度接種至培養(yǎng)器皿，于37℃，5%CO?培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)至匯合度90%，棄掉上清，加入成脂誘導分化培養(yǎng)基誘導液。
NOTE：如細胞貼壁性較差，建議使用 0.1%明膠對培養(yǎng)底 面進行包被。
1.2 細胞分化誘導于37℃，5%CO?培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)約3天，更換為成脂誘導分化培養(yǎng)基維持液，培養(yǎng)1天后， 再更換為成脂誘導分化培養(yǎng)基誘導液，繼續(xù)培養(yǎng)3天。
按照以上換液頻率誘導14~21天，并注意觀 察細胞形態(tài)變化。根據(jù)細胞誘導形成的脂滴數(shù)量 和大小，決定終止細胞誘導的時間，并進行染色 鑒定。
2.染色鑒定
2.1 細胞固定吸去培養(yǎng)基使用適量1×PBS清洗一次，棄去后取適量4%中性甲醛溶液覆蓋培養(yǎng)器皿底面，室 溫固定 30~60 min，棄去固定液再使用1×PBS清洗兩次。
2.2 油紅O染色取生理鹽水或1×PBS與油紅O原液配制油紅O工作液（油紅O原液: 生理鹽水=3:2），現(xiàn)用現(xiàn) 配。配制后可對油紅O工作液進行離心，以沉淀 染色液中的過飽和析出物。向清洗干凈的誘導孔內加入適量油紅O工作液，靜置染色30min。吸走油紅O工作液，用1×PBS清洗兩次，并加入適量1×PBS避免細胞干燥。
2.3誘導評估顯微鏡下觀察成脂染色效果，并進行圖像采集和誘導評估。誘導成功時，脂滴與油紅O染料 結合后呈現(xiàn)紅色或橘紅色。
NOTE: 成脂分化水平因細胞類型、培養(yǎng)條件、細胞代次、細胞狀態(tài)和分化時間等因素而異。
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