原生質(zhì)體葉肉細胞瞬時表達實驗步驟
1、生長培養(yǎng)好的試驗材料(一般為生長20天左右的擬南芥幼苗葉片)
2、在擬南芥開花前取樣(30片葉子左右即可)
3、切取葉片為0.5-1mm的細條(如果材料能達到每克107個原生質(zhì)體,10-20片葉子需要5-10mL酶解液)
4、迅速將切下的樣品轉(zhuǎn)到酶解液中,要求全浸沒。
5、黑暗條件下抽真空30min。
6、連續(xù)酶解,室溫下23℃黑暗中靜止酶解3h
7、利用光學(xué)顯微鏡檢查原生質(zhì)體(30-50μm大小)
8、在過濾前加入等量的W5溶液
9、洗干凈濾網(wǎng),并用W5潤濕,之后過濾
10、離心100g,1-2min沉淀原生質(zhì)體,盡可能吸走上清,重復(fù)洗2次
11、重懸原生質(zhì)體于W5中,保持在2*105個/ml,冰浴30min。
12、100g離心2min,盡可能吸走上清,利用MMG重懸,濃度約2*105個/ml
13、加入10μL質(zhì)粒(1000ng-2000ng)于2ml離心管中
14、加入100μL原生質(zhì)體(2*104個),輕輕混勻。
15、加110μL PEG solution,輕彈使充分混勻
16、23℃室溫孵育30min。
17、加400-440μL W5混勻,終止反應(yīng)
18、100g,2min 23℃離心,去上清,重復(fù)洗一次
19、用1mL W5重懸原生質(zhì)體并放入6孔板中培養(yǎng)
20、20-25℃孵育16h以上
21、取樣制片觀察
溶液配制:
1、酶解液的配制(20ml)試劑終濃度質(zhì)量/g
試劑 | 終濃度 | 質(zhì)量/g | |
MES | 20mM | 0.08528 | KOH調(diào)pH5.7 |
D-Mannitol | 0.4M | 1.45736 | |
KCl | 20mM | 0.02982 | |
macerozyme R-10 | 0.40% | 0.08 | |
Cellulase R-10 | 1.50% | 0.3 | |
55℃水浴10min,待冷卻后再加以下試劑 | |||
CaCl2·2H2O | 10mM | 0.029402 | |
BSA | 0.10% | 0.02 |
W5溶液配制(500mL)
試劑 | 終濃度 | 質(zhì)量/g | |
MES | 2mM | 0.19524 | KOH調(diào)pH5.7 |
NaCl | 154mM | 4.49988 | |
CaCl2·2H2O | 125mM | 9.18825 | |
KCl | 5mM | 0.186375 |
MMG配制(100mL)
試劑 | 終濃度 | 質(zhì)量/g | |
MES | 4mM | 0.078096 | KOH調(diào)pH5.7 |
D-Mannitol | 0.4M | 7.2868 | |
MgCl2·6H2O | 15mM | 0.30495 |
PEG配制(10mL)
試劑 | 終濃度 | 質(zhì)量/g |
PEG 4000 | 40% | 4 |
D-Mannitol | 0.2M | 0.36434 |
CaCl2·2H2O | 100mM | 0.14701 |