原生質(zhì)體葉肉細胞瞬時表達實驗步驟
1、生長培養(yǎng)好的試驗材料（一般為生長20天左右的擬南芥幼苗葉片）
2、在擬南芥開花前取樣（30片葉子左右即可）
3、切取葉片為0.5-1mm的細條（如果材料能達到每克107個原生質(zhì)體，10-20片葉子需要5-10mL酶解液）
4、迅速將切下的樣品轉(zhuǎn)到酶解液中，要求全浸沒。
5、黑暗條件下抽真空30min。
6、連續(xù)酶解，室溫下23℃黑暗中靜止酶解3h
7、利用光學(xué)顯微鏡檢查原生質(zhì)體（30-50μm大?。?/span>
8、在過濾前加入等量的W5溶液
9、洗干凈濾網(wǎng)，并用W5潤濕，之后過濾
10、離心100g，1-2min沉淀原生質(zhì)體，盡可能吸走上清，重復(fù)洗2次
11、重懸原生質(zhì)體于W5中，保持在2*105個/ml，冰浴30min。
12、100g離心2min，盡可能吸走上清，利用MMG重懸，濃度約2*105個/ml
13、加入10μL質(zhì)粒（1000ng-2000ng）于2ml離心管中
14、加入100μL原生質(zhì)體（2*104個），輕輕混勻。
15、加110μL PEG solution，輕彈使充分混勻
16、23℃室溫孵育30min。
17、加400-440μL W5混勻，終止反應(yīng)
18、100g，2min 23℃離心，去上清，重復(fù)洗一次
19、用1mL W5重懸原生質(zhì)體并放入6孔板中培養(yǎng)
20、20-25℃孵育16h以上
21、取樣制片觀察
溶液配制：
1、酶解液的配制（20ml）試劑終濃度質(zhì)量/g
| 試劑 | 終濃度 | 質(zhì)量/g | |
| MES | 20mM | 0.08528 | KOH調(diào)pH5.7 |
| D-Mannitol | 0.4M | 1.45736 | |
| KCl | 20mM | 0.02982 | |
| macerozyme R-10 | 0.40% | 0.08 | |
| Cellulase R-10 | 1.50% | 0.3 | |
| 55℃水浴10min，待冷卻后再加以下試劑 | |||
| CaCl2·2H2O | 10mM | 0.029402 | |
| BSA | 0.10% | 0.02 | |
W5溶液配制（500mL）
| 試劑 | 終濃度 | 質(zhì)量/g | |
| MES | 2mM | 0.19524 | KOH調(diào)pH5.7 |
| NaCl | 154mM | 4.49988 | |
| CaCl2·2H2O | 125mM | 9.18825 | |
| KCl | 5mM | 0.186375 |
MMG配制（100mL）
| 試劑 | 終濃度 | 質(zhì)量/g | |
| MES | 4mM | 0.078096 | KOH調(diào)pH5.7 |
| D-Mannitol | 0.4M | 7.2868 | |
| MgCl2·6H2O | 15mM | 0.30495 |
PEG配制（10mL）
| 試劑 | 終濃度 | 質(zhì)量/g |
| PEG 4000 | 40% | 4 |
| D-Mannitol | 0.2M | 0.36434 |
| CaCl2·2H2O | 100mM | 0.14701 |
