原生質(zhì)體葉肉細胞瞬時表達實驗步驟

原生質(zhì)體葉肉細胞瞬時表達實驗步驟
1、生長培養(yǎng)好的試驗材料（一般為生長20天左右的擬南芥幼苗葉片）
2、在擬南芥開花前取樣（30片葉子左右即可）
3、切取葉片為0.5-1mm的細條（如果材料能達到每克107個原生質(zhì)體，10-20片葉子需要5-10mL酶解液）
4、迅速將切下的樣品轉(zhuǎn)到酶解液中，要求全浸沒。
5、黑暗條件下抽真空30min。
6、連續(xù)酶解，室溫下23℃黑暗中靜止酶解3h
7、利用光學(xué)顯微鏡檢查原生質(zhì)體（30-50μm大小）
8、在過濾前加入等量的W5溶液
9、洗干凈濾網(wǎng)，并用W5潤濕，之后過濾
10、離心100g，1-2min沉淀原生質(zhì)體，盡可能吸走上清，重復(fù)洗2次
11、重懸原生質(zhì)體于W5中，保持在2*105個/ml，冰浴30min。
12、100g離心2min，盡可能吸走上清，利用MMG重懸，濃度約2*105個/ml
13、加入10μL質(zhì)粒（1000ng-2000ng）于2ml離心管中
14、加入100μL原生質(zhì)體（2*104個），輕輕混勻。
15、加110μL PEG solution，輕彈使充分混勻
16、23℃室溫孵育30min。
17、加400-440μL W5混勻，終止反應(yīng)
18、100g，2min 23℃離心，去上清，重復(fù)洗一次
19、用1mL W5重懸原生質(zhì)體并放入6孔板中培養(yǎng)
20、20-25℃孵育16h以上
21、取樣制片觀察
 
溶液配制：
1、酶解液的配制（20ml）試劑終濃度質(zhì)量/g

W5溶液配制（500mL）

MMG配制（100mL）

PEG配制（10mL）