1. 重組慢病毒的制備
Day1: 匯合度90%的10cm dishs HEK293T細(xì)胞(~ 6×107/dish)按1:1比例傳代至15cm dishs,第二天細(xì)胞匯合度達(dá)到90%-95%(~ 1.5×108/dish),培養(yǎng)基為Gibico高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS)。
Day2: 轉(zhuǎn)染前2-3個小時更換培養(yǎng)基(含10%FBS);
2)按照以下比例配制轉(zhuǎn)染試劑:
Mix 1體積μlMix 2量DMEM(無FBS)1000μlDMEM(無FBS)1000μl目的基因質(zhì)粒25μgVGF190μl(1μg/μl)PMD2G7.5μgPSPAX215μg
Mix 1和Mix 2分別混合后,室溫5-10min, 后將Mix 1和Mix 2混合,室溫30min,加入至15cm dish中。(細(xì)胞達(dá)到匯合度90%,細(xì)胞過少會影響轉(zhuǎn)染效率)
Day3: 6h-24h內(nèi)更換新鮮培養(yǎng)基(含10%FBS),觀察轉(zhuǎn)染效率并拍照。
Day5: 72h觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照。收取上清培養(yǎng)基,過0.45μm濾膜,上清培養(yǎng)基加入超速離心管中,配平后離心,25000rpm,4℃離心1.5h。棄上清,用適當(dāng)病毒保存液回溶混勻溶解過夜。
Day6:收集病毒分裝,進行病毒滴度測定。
2. 重組慢病毒滴度測定
2.1 整合數(shù)法標(biāo)定不帶熒光的重組慢病毒滴度
2.1.1 病毒感染細(xì)胞
①感染前6 h 在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中以2.5×105個細(xì)胞/孔 均勻接種HEK293細(xì)胞。
②將慢病毒進行梯度稀釋,共做3個梯度,即每孔(500μl 無雙抗、無血清的DMEM培養(yǎng)基)中含10 μl、1 μl、0.1 μl 病毒,振蕩混勻后加至接種好細(xì)胞的24孔板中,加病毒之前將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸凈。
③感染 18-20h 后,將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為新鮮的DMEM完培。
④感染 64-68h 后收集細(xì)胞并進行基因組DNA的提取。
⑤測定時,設(shè)置一組帶熒光的已知TU的慢病毒作為對照,以校驗檢測出的數(shù)值。
2.1.2 提取基因組DNA(按照AxyGEN 的基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作)
2.1.3 qPCR檢測
① 以被測慢病毒載體梯度稀釋為標(biāo)準(zhǔn)品,慢病毒載體上的通用引物進行qPCR以獲得病毒整合拷貝數(shù)。
② 以Actin質(zhì)粒梯度稀釋為標(biāo)準(zhǔn)品,Actin引物進行qPCR檢測樣品的基因組拷貝數(shù)以得到基因組拷貝數(shù)。
③ qPCR
qPCR反應(yīng)體系如下:
組成成分體積2 × SYBR Green mix10 μlPrimers (Forward & Reverse mixture)0.8 μl超純水(DNase & RNase Free)7.2μl模板2μlTotal20μl
qPCR反應(yīng)程序:
循環(huán)參數(shù)預(yù)變性95℃ 3min;95℃ 5S;60℃ 15S;72℃ 15S+Plate Read39個循環(huán)
2.1.4 計算慢病毒IU(Integration Unit)/ml
IU/ml=(C×N×D×1000)/V
注:C=平均每基因組慢病毒整合拷貝數(shù)D=病毒的稀釋倍數(shù)N=感染時細(xì)胞的數(shù)目(約為2.5×10E5)V=加入稀釋病毒的體積數(shù)
2.2 孔稀釋法標(biāo)定帶熒光的重組慢病毒滴度
Day1: 細(xì)胞的準(zhǔn)備
在96孔板中的每個孔中接種1-4×104個 HEK293細(xì)胞。
Day2: 病毒的稀釋與感染
在Eppendorf管中做10倍梯度稀釋,分別是1~10-6梯度。棄去96孔板中原有的培養(yǎng)基,將稀釋好的病毒依次加入孔中,注意是兩個重復(fù),并做好標(biāo)記。
Day5: 熒光計數(shù)與滴度計算
感染72h后,用熒光顯微鏡對熒光陽性細(xì)胞進行計數(shù)。數(shù)出最后兩孔的熒光細(xì)胞數(shù),計算2個重復(fù)孔內(nèi)的總數(shù)之和并計算出平均數(shù),假設(shè)為A(倒數(shù)第二孔的熒光細(xì)胞平均數(shù))和B(倒數(shù)第一孔的熒光細(xì)胞平均數(shù))。
慢病毒滴度計算公式:病毒滴度 (TU/ml) = (A+B×10)×1000/2/A孔病毒量(μl)
3. 慢病毒的使用
3.1 重組慢病毒體外感染細(xì)胞
不同的細(xì)胞所使用的病毒MOI值會有所不同。建議在正式實驗前,在目的細(xì)胞中進行預(yù)實驗摸索最佳MOI值。
3.1.1 慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實驗
為了節(jié)省病毒,推薦使用96孔板進行預(yù)實驗。操作步驟如下:
①Day1 細(xì)胞的準(zhǔn)備
將目的細(xì)胞接種于96孔板中,細(xì)胞融合率為50%為最佳。為保證細(xì)胞生長良好,請保證細(xì)胞貼壁過夜。
②Day2 病毒的稀釋
取10μL慢病毒原液加入90μL培養(yǎng)液中做1:10稀釋(10-1),以此為起點做梯度稀釋直至稀釋10-7??筛鶕?jù)實際情況降低或提高稀釋倍數(shù)。
③Day2 感染目的細(xì)胞
取出提前準(zhǔn)備好的96孔板,用準(zhǔn)備好的病毒稀釋液替代舊培養(yǎng)液,注意保留未加入病毒的細(xì)胞孔作為對照組。
④第Day2~Day10 觀察熒光或檢測
慢病毒對細(xì)胞的感染較慢,請在感染細(xì)胞后48、72、96、120小時分別觀察細(xì)胞中熒光表達(dá)情況(如果您選擇的產(chǎn)品不帶有熒光標(biāo)簽,請在48、72、96、120小時分別收獲細(xì)胞并通過 Western-Blot 或其他檢測手段來檢測基因表達(dá))。
注意:由于不同細(xì)胞對慢病毒感染過程的承受能力不同,在加入病毒稀釋液后,請于12-24小時后觀察細(xì)胞狀態(tài)以確認(rèn)加入的病毒量是否合適。
3.1.2 慢病毒感染目的細(xì)胞
進行慢病毒感染實驗時可使用完培(培養(yǎng)目的細(xì)胞用)稀釋。培養(yǎng)液中的血清、雙抗或其他營養(yǎng)因子不會影響慢病毒的感染效率。
以24 孔培養(yǎng)板為例,進行HEK293細(xì)胞的感染實驗操作步驟如下:
注意:實驗前請按照不同的MOI 設(shè)置不同的感染孔,并根據(jù)MOI 和細(xì)胞數(shù)量計算所需要的病毒量。
最適病毒用量的計算公式:病毒用量TU=最佳MOI×細(xì)胞數(shù)目/病毒滴度
例如, 如果您目的細(xì)胞的最佳MOI=10,您需要感染106的細(xì)胞,那么您共計需要107 TU的病毒. 如果病毒滴度為1×108 TU/mL, 那么您實驗需要的病毒量就是100μL.
① Day1 細(xì)胞的準(zhǔn)備
在24孔培養(yǎng)板接種若干孔,每個孔內(nèi)接種3-5×104個HEK 293細(xì)胞,鋪板時細(xì)胞的融合率為50%左右,每孔培養(yǎng)液體積為300μL,進行病毒感染時細(xì)胞的匯合度約為70%。
②Day2 病毒的準(zhǔn)備
根據(jù)實驗的實際情況和MOI 值,用培養(yǎng)液準(zhǔn)確稀釋慢病毒原液。
注意:可使用PBS緩沖液或無血清培養(yǎng)液稀釋病毒原液。
③Day2 感染目的細(xì)胞
在目的細(xì)胞和對照細(xì)胞中分別加入計算好的病毒液, 混勻后放于CO2培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)孵育過夜。
注意:1)感染前細(xì)胞的狀態(tài)好壞對最終的感染效果高低影響很大,請務(wù)必保證加入病毒前,細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。
2)若慢病毒對目的細(xì)胞的感染效率較低,可通過提高MOI 值提高病毒的感染效率,也可在培養(yǎng)液中加入維真生物助感染試劑ADV-HR來提高病毒的感染效率。
④Day3 更換培養(yǎng)液
病毒感染細(xì)胞24小時后,更換培養(yǎng)液。
注意:換液具體時間需視細(xì)胞狀態(tài)而定。如果慢病毒對細(xì)胞有明顯毒性作用,影響細(xì)胞生長狀態(tài),最短可于加病毒4小時后更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。
⑤Day6 感染效率檢測
在倒置熒光顯微鏡觀察熒光,計算慢病毒感染目的細(xì)胞的效率。如選擇的慢病毒載體不帶有熒光標(biāo)記,可以通過Q-PCR(定量PCR)檢測目的基因的表達(dá)來評估感染效率。
注意:1)慢病毒表達(dá)較慢,熒光表達(dá)所需時間較長,建議感染96小時后觀察熒光的表達(dá)。
2)感染后的細(xì)胞可以連續(xù)培養(yǎng)一周,通過觀察熒光表達(dá)的時間和強度來確定慢病毒對目的細(xì)胞的感染情況。
3)感染期間,請根據(jù)細(xì)胞生長的情況及時換液,以保證細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。
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2、可以滿足不同細(xì)胞的穩(wěn)轉(zhuǎn)的需求;
3、攜帶抗性用于穩(wěn)轉(zhuǎn)構(gòu)建;
4、表達(dá)穩(wěn)定適合用于基因敲除;
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