流式細(xì)胞技術(shù)介紹

  流式細(xì)胞技術(shù)是一項廣為使用、基于激光的生物學(xué)技術(shù)，利用流式細(xì)胞儀對處于 快速流動的熒光染色的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析和分選，是當(dāng)代主要的細(xì)胞定量分析技術(shù)之一。主要有以下幾個特點：
1.只要樣本制成單個細(xì)胞或生物顆粒懸液均可以分析。
2.測量速度快，每秒鐘可以測量數(shù)千個乃至數(shù)萬個細(xì)胞
3.同時測量每個細(xì)胞的多參數(shù)特征。
4.在進(jìn)行細(xì)胞特征分析的同時可以把有特征細(xì)胞分離出來(分選技術(shù))
關(guān)于流式細(xì)胞儀
流式細(xì)胞儀由三部分構(gòu)成——
1.液流系統(tǒng)，包括流動室和液流驅(qū)動系統(tǒng)；
2.光學(xué)系統(tǒng)，包括激發(fā)光源和光束收集系統(tǒng)；
3.電子系統(tǒng)，包括光電轉(zhuǎn)換器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

流式細(xì)胞儀工作原理
流式細(xì)胞儀的工作原理是使懸浮在液體中分散的經(jīng)熒光標(biāo)記的細(xì)胞或微粒逐個 通過樣品池，同時由熒光探測器捕獲熒光信號并轉(zhuǎn)換成分別代表前向散射角、側(cè) 向散射角和不同熒光強度的電脈沖信號，經(jīng)計算機處理形成相應(yīng)的點圖，直方圖和加三維結(jié)構(gòu)圖像進(jìn)行分析。
目前臨床中運用流式細(xì)胞儀進(jìn)行外周血白細(xì)胞、骨髓細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞等的檢測，是臨床檢測的重要組成部分。

流式細(xì)胞術(shù)基本原則
1.使各種液體和懸浮細(xì)胞樣本新鮮，盡快完成樣本制備和檢測；
2.針對不同的細(xì)胞樣本進(jìn)行適當(dāng)洗滌、酶消化或 EDTA 處理，以清除雜質(zhì)，使粘附的細(xì)胞彼此分離而形成單細(xì)胞狀態(tài)；
3.對新鮮實體瘤組織可選用或聯(lián)用酶消化法，機械打散法和化學(xué)分散法來獲得足夠數(shù)量的單細(xì)胞懸液；
4.對石蠟包埋組織應(yīng)先切成若干40-50um 厚的蠟片，經(jīng)二甲苯脫蠟到水后，再用前述方法制備單細(xì)胞懸液；
5.單細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)不應(yīng)少于10000個。 
 
實驗步驟
1.制備單細(xì)胞懸液
將待測細(xì)胞或微粒制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料標(biāo)記抗體進(jìn)行染色。在恒 定氣體的壓力下進(jìn)入流動室，不含細(xì)胞或微粒的緩沖液在高壓下從鞘液管噴出。 鞘液管入口方向與待測樣品流形成一定角度，鞘液包繞著樣品高速流動，組成一個圓柱形的液流束。待測細(xì)胞或微粒在鞘液的包被下單行排列，依冷通過檢測區(qū)域。
2.其次，收集單細(xì)胞上的熒光信號
流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源，經(jīng)過聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流 上，細(xì)胞或微粒上的熒光染料被激發(fā)，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。光散射信號在前 向小角度進(jìn)行檢測，這種信號基本上反映了細(xì)胞體積的大小；熒光信號的接受方 向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。
3.再次，統(tǒng)計結(jié)果
熒光信號的強度代表了所測細(xì)胞膜表面抗原強度或細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的濃度，經(jīng)光電轉(zhuǎn) 換變?yōu)榭杀挥嬎銠C識別的數(shù)字信號。計算機把所測量到的各種信號進(jìn)行計算機處
理，將分析結(jié)果顯示在計算機上。
4.最后，做細(xì)胞分選
細(xì)胞的分選是指根據(jù)所測定的各個參數(shù)將細(xì)胞從細(xì)胞群體中分離出來的 一種方式，通過分離含有單細(xì)胞的液滴實現(xiàn)。在流動室的噴口上方配有一個超高頻的壓電晶體，產(chǎn)生的振動使噴出的液流形成均勻的液滴，待測細(xì)胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負(fù)不同的電荷，當(dāng)液滴流經(jīng)帶有幾千伏特的偏轉(zhuǎn)板時，在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現(xiàn)細(xì)胞的分離。 
流式細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用
1.其測定細(xì)胞內(nèi)DNA 的變異系數(shù)最小， 一般在2%以下；
2.能準(zhǔn)確地進(jìn)行DNA 倍體分析；
3.借助于熒光染料進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的定量研究；
4.快速進(jìn)行細(xì)胞分選和細(xì)胞收集；
5.醫(yī)學(xué)應(yīng)用：免疫功能研究各種干細(xì)胞的檢測，癌癥病人的多藥耐藥性，細(xì)胞功能 及代謝動力學(xué)研究，血小板分析(心血管疾病),流式細(xì)胞術(shù)與分子生物學(xué)研究；
6.應(yīng)用于外周血內(nèi)皮細(xì)胞測定、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞等領(lǐng)域。
 
流式細(xì)胞儀的應(yīng)用
(一)、檢測細(xì)胞凋亡
1.亞 G1 峰檢測：凋亡細(xì)胞雙鏈 DNA 發(fā)生裂解導(dǎo)致染色質(zhì)濃集。 DNA 降解后，形
成長度為180-200bp 的 DNA 片段，成為凋亡小體。而常規(guī)壞死的DNA 分解是隨機的， DNA 片段大小不一，在流式細(xì)胞檢測上可出現(xiàn)比亞二倍體 (G1) 峰更小的細(xì)胞碎片峰。
2.Annexin V/PI雙染色法：當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時， PS (磷酯酰絲氨酸)從細(xì)胞膜內(nèi) 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使 PS 暴露在細(xì)胞膜表面， Annexin V 具有易于結(jié)合 PS 的磷 脂結(jié)合蛋白。因此，建立一種用Annexin V結(jié)合在細(xì)胞膜表面作為凋亡的指標(biāo)并 結(jié)合一種染料排出試驗已檢測細(xì)胞膜的完整性的檢測方法。該法使用 FITC 標(biāo)記AnnexinV, 同時結(jié)合使用PI標(biāo)記細(xì)胞核。
3.JC-1 染色法檢測線粒體膜電位： JC-1 有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)。低濃度 時，以單體存在，可檢測到綠色熒。,用流式檢測時，通常為 FL-1 通道。高濃度 時，以多聚體存在，可檢測到紅光，流式檢測通常為 FL-2 通道。細(xì)胞膜電位正 常時，JC-1 通過線粒體膜極性進(jìn)入線粒體內(nèi)，并因濃度升高而形成發(fā)射紅色熒光 的多聚體。而凋亡細(xì)胞，線粒體跨膜電位去極化， JC-1 從線粒體內(nèi)釋放，濃度降 低，逆轉(zhuǎn)為發(fā)射綠色熒光的單體形式。故而可以通過檢測綠色和紅色熒光檢測線粒體膜電位的變化。