大腸桿菌（E.coli）表達(dá)重組蛋白的技術(shù)經(jīng)過多年的發(fā)展，已經(jīng)成為一個非常成熟表達(dá)系統(tǒng)。為了在大腸桿菌表達(dá)體系中獲得可溶以高表達(dá)產(chǎn)量的蛋白，一個優(yōu)秀的表達(dá)策略是重要的。
為了高效表達(dá)有活性蛋白，一般需考慮以下幾個因素：
1.宿主體系的選擇
細(xì)菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞、絲狀真菌和單細(xì)胞藻類均可以作為表達(dá)宿主，每一種表達(dá)宿主都有各自的優(yōu)缺點。如果需要表達(dá)的蛋白具有真核的翻譯后修飾（糖基化修飾），那么可以選擇酵母、哺乳動物細(xì)胞等，而大腸桿菌等原核表達(dá)體系則不適用。
大腸桿菌作為表達(dá)外源蛋白廣泛體系，其優(yōu)點主要包括：（1）菌體繁殖速度快，20分鐘即繁殖一代，如果按照1/100的比例進(jìn)行接種（MOI），只需要對其培養(yǎng)幾個小時即可到達(dá)穩(wěn)定期；（2）容易實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，理論培養(yǎng)密度是1×10^13 cells/ml，實際培養(yǎng)過程中如果使用的是LB培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)密度一般比1×10^10 cells/ml略小。而在低溫（<11℃）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)時，細(xì)菌個數(shù)幾乎不增長。（3）比較容易轉(zhuǎn)染外源DNA，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率非常高。
2.質(zhì)粒的選擇
一般來說，重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體融合了復(fù)制子(Replicon)、啟動子(promoter)、親和標(biāo)簽(affinity tags)、篩選標(biāo)記(selection marker)、多克隆位點（MCS）和融合蛋白去除策略(fusion tag removal strategy)，如下圖所示：
復(fù)制子：包含復(fù)制起始點及相關(guān)順式作用控制元件（cis-acting control elements）。在選擇質(zhì)粒載體時，質(zhì)?？截悢?shù)是一個非常重要參數(shù)，應(yīng)重點考慮。目前可從市場上購買到的載體非常多，如pET、pUC、pACYC 、pBAD和pSC101等。pET系列載體含有pMB1起始子，在單個菌體中該類質(zhì)粒的拷貝數(shù)通常為15-60；pUC系列含有一個突變的pMB1起始子，在該系列的載體在單個細(xì)菌中的拷貝數(shù)通常為500–700；pACYC和pBAD系列常被用于雙表達(dá)體系，如FRET系統(tǒng)，該系列含有p15A起始子，單個細(xì)胞中質(zhì)粒的拷貝數(shù)為10-12；pSC101系列載體在單個細(xì)胞中的拷貝數(shù)較少，通常<5個，此類載體常被用于三種蛋白的共表達(dá)。
啟動子：在重組蛋白大腸桿菌表達(dá)體系中，有多種啟動子，入Lac、tac、T7、pL、cspA啟動子等。lac啟動子是最為常用的啟動子之一，當(dāng)培養(yǎng)基中只有乳糖（lactose）作為碳源時，lac啟動子被激活，開始表達(dá)重組蛋白。T7啟動子作為另外一種經(jīng)常使用的啟動子，當(dāng)含有T7啟動系統(tǒng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)菌后，培養(yǎng)至一定濃度后，加入IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，一種非水解性的乳糖類似物）即可誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)重組蛋白。
抗性篩選標(biāo)簽：質(zhì)粒載體通常采用的抗性基因包括氨芐青霉素，卡那霉素，氯霉素，慶大霉素和四環(huán)素等抗性基因，在重組蛋白表達(dá)與純化過程中，大部分加入的外源抗生素自然降解(如氨芐青霉素37℃條件下半衰期為16小時)或被去除掉，只剩下微量殘留（一般<1pg/ml純化蛋白），我們開發(fā)了相應(yīng)的ELISA試劑盒能夠快速檢測抗生素殘留量（檢測靈敏度0.1pg/ml）。
融合標(biāo)簽：為了使蛋白的下游純化過程更加容易以及促進(jìn)某些不溶性蛋白可溶表達(dá)，通常在表達(dá)目標(biāo)蛋白的N端或C端會加入融合標(biāo)簽。融合標(biāo)簽可分兩類：一類是短肽類標(biāo)簽；一類是長肽類標(biāo)簽，主要以融合蛋白（fused partner）形式共表達(dá)。短肽標(biāo)簽主要作用是使蛋白下游純化更加快捷高效，長肽類標(biāo)簽更多的作用是促進(jìn)蛋白可溶性表達(dá)；短肽類標(biāo)簽一般只含幾個氨基酸，分子量一般小于2 kDa，對重組蛋白的性質(zhì)影響較小。親和標(biāo)簽可以放置在蛋白的C-端或N-端，如需要表達(dá)分泌性蛋白，一般放置于C-端，信號肽通常放置于N-端。不同的蛋白標(biāo)簽需要根據(jù)具體案例來分析，常用的蛋白標(biāo)簽性質(zhì)，如下表所示
標(biāo)簽去除的酶切位點：對于一般性的生物學(xué)研究，蛋白標(biāo)簽可以不用去除，如pull down實驗和CO-IP實驗，通常需要保留標(biāo)簽(如GST、His標(biāo)簽等)以便將目的蛋白從混合物中直接分離出來。當(dāng)涉及到蛋白結(jié)構(gòu)研究時，則需要去除目標(biāo)蛋白的融合標(biāo)簽或融合伴侶。去除蛋白標(biāo)簽的方法可分為兩類，一類是酶消化法；一類是化學(xué)裂解法?；瘜W(xué)裂解法通產(chǎn)被用于融合伴侶蛋白的去除，如CNBr用于裂解與Met氨基酸C-端連接的多肽，該方法優(yōu)點是價格便宜，缺點是蛋白序列中不能存在其他的Met殘基。另一種最為常用的蛋白標(biāo)簽去除方法為酶消化法，如腸激脢（Enterokinase），凝血酶（thrombin），factor Xa和煙草蝕紋病毒蛋白酶 (TEV protease)等移除蛋白標(biāo)簽，使用酶法進(jìn)行標(biāo)簽的切除通常會殘留少數(shù)幾個氨基酸殘基。其中帶有His標(biāo)簽的TEV作為一個被廣泛用于蛋白標(biāo)簽去除實驗的標(biāo)簽，其具有一個非常優(yōu)秀的特點:在切除標(biāo)簽后，只殘留一個Ser或Gly殘基或不殘留氨基酸殘基。
3.蛋白表達(dá)宿主的選擇
在使用大腸桿菌表達(dá)重組蛋白時，常采用BL21（DE3）和K-12衍生菌株作為表達(dá)宿主。Studier 于1986年提出BL21菌株，隨后不同基因工程修飾菌株相繼誕生。BL21菌株缺乏Lon蛋白酶和外膜蛋白酶OmpT。Lon蛋白酶主要功能是降解外源蛋白，外膜蛋白酶OmpT主要功能是降解胞外基質(zhì)蛋白。同時BL21菌株具有先天性的hsdSB基因突變，菌株失去甲基化和降解外源轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的能力，使得質(zhì)粒能夠傳代保留至子代細(xì)菌中（hsdSB突變基因來源于父輩B834菌株）。另一種時K-12系列菌株，該系列菌株具有兩大優(yōu)點：一個是能夠促進(jìn)胞質(zhì)中蛋白二硫鍵的形成(主要原因是trxB（thioredoxin reductase）基因發(fā)生突變)；另一個是外源質(zhì)粒能夠在宿主菌種中穩(wěn)定存在(主要原因時recA基因發(fā)生了突變)。
常見的重組蛋白表達(dá)技術(shù)問題匯總
重組蛋白表達(dá)永遠(yuǎn)不是一蹴而就的事情，任何一種方案不會適用于所有案例，蛋白表達(dá)可以說是一個不斷嘗試的過程，下表總結(jié)了一些常見的蛋白表達(dá)技術(shù)問題及其應(yīng)對策略。
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