大多數(shù)用于抗體生產(chǎn)的細(xì)胞主要基于動(dòng)物細(xì)胞上的開(kāi)發(fā),如 MRC-5 人二倍體細(xì)胞、 Vero 猿猴腎上皮細(xì)胞、Madin-Darby 犬腎 (MDCK) 細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞 。尤其是來(lái)自非洲綠猴腎臟的 Vero 細(xì)胞已被廣泛用于vaccine生產(chǎn),因?yàn)樗鼈儽籛HO機(jī)構(gòu)證明沒(méi)有致癌潛力。許多vaccine,例如針對(duì)基孔肯雅熱、登革熱、日本腦炎、病毒性胃腸炎、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病、羅斯河熱、嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥、天花、西尼羅河腦炎和流感的 vaccine都是使用 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)開(kāi)發(fā)的。
用于virus vaccine生產(chǎn)的細(xì)胞依賴于貼壁,因此涉及這些細(xì)胞的過(guò)程不能輕易擴(kuò)大規(guī)模,因?yàn)樾枰N壁空間和胰蛋白酶消化。這導(dǎo)致了具有懸浮生長(zhǎng)能力的永生和穩(wěn)定細(xì)胞系的發(fā)展.近期研究中,研究人員成功地在微載體上培養(yǎng)了 Vero 細(xì)胞,用于制備這些細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物。實(shí)驗(yàn)表明,在沒(méi)有微載體的情況下培養(yǎng)的懸浮適應(yīng)性 Vero 細(xì)胞比貼壁 Vero 細(xì)胞產(chǎn)生更高量的 virus。
Vero 細(xì)胞培養(yǎng)使用動(dòng)物來(lái)源的成分較多,如血清、胰蛋白酶、乳清蛋白等。由于成本高和批次間差異,盡量使用血清。此外,牛血清的病毒、細(xì)菌和真菌、支原體污染也是細(xì)胞培養(yǎng)中的主要污染來(lái)源。因此,無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)體系的優(yōu)化對(duì)于疫苗株的生產(chǎn)是必要的。 之前的研究中,在無(wú)血清 EX-Cell MDCK 中培養(yǎng)的 MDCK 細(xì)胞比在含血清的 Glasgow 低必需培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生更多的 virus。此外,還探索了在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng) Vero 細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)許多virus vaccine。
在這項(xiàng)研究中,我們?cè)噲D促進(jìn) Vero 細(xì)胞在振蕩懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中的適應(yīng)性,并確定哪種培養(yǎng)基適合在無(wú)血清的情況下培養(yǎng) Vero 細(xì)胞。與傳統(tǒng)的 Vero 細(xì)胞貼壁培養(yǎng)相比,Vero 細(xì)胞成功地適應(yīng)了懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)并產(chǎn)生了更多的 Adv。
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:
Vero 和 FRhk-4 細(xì)胞使用 10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中添加1u/mL的青霉素和 1 µg/mL 鏈霉素。培養(yǎng)條件為 5% CO2含量,37℃。
MRC-5 細(xì)胞在含有 10% FBS 和 1 U/mL 青霉素和 1 µg/mL 鏈霉素的改良型 Eagle 培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為 5% CO 2中, 37℃培養(yǎng)。
5 型 Adv (Ad5) - GFP綠色熒光蛋白 。使用含有 2% FBS 的 DMEM 在 Vero 細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染繁殖。
一、培養(yǎng)基的選擇性實(shí)驗(yàn)
OptiPRO SFM 和 VP-SFM 是無(wú)血清、超低蛋白培養(yǎng)基,不含蛋白質(zhì)、肽或其他動(dòng)物或人類(lèi)來(lái)源的成分。
Gibco 的Opt-MEM 減血清培養(yǎng)基是一種改進(jìn)的 MEM,可以減少 FBS 的添加量。UltraCULTURE 培養(yǎng)基是一種無(wú)血清培養(yǎng)基,設(shè)計(jì)用于培養(yǎng)補(bǔ)充有重組人胰島素、牛轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清蛋白(包括白蛋白)的純化混合物的哺乳動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型。
SFM4MegaVir屬于一種無(wú)蛋白培養(yǎng)基,使用這種培養(yǎng)基的目的在于提高不含動(dòng)物來(lái)源成分的virus vaccine生 產(chǎn)過(guò)程的產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要 逐步降低 FBS 的百分比值,來(lái)適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)條件。
我們主要在Optipro、UltraCULTURE、SFM4MegaVir、OptiMEM 和 VP-SFM這五種培養(yǎng)基中嘗試了細(xì)胞適應(yīng)。
1.細(xì)胞在 5% CO2 下培養(yǎng)2條件37℃。將細(xì)胞以1×10 6 個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿的濃度接種在細(xì)胞培養(yǎng)皿中。
2.在 37℃、5% CO 2條件下培養(yǎng) 72 小時(shí)后,使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和 0.4% 臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定總細(xì)胞數(shù),然后用 1×10 6 個(gè)細(xì)胞/盤(pán),逐步減少常規(guī)培養(yǎng)基的百分比。
3.使用放大 100 倍的倒置相差顯微鏡根據(jù)細(xì)胞數(shù)量和形狀評(píng)估在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的形態(tài)。
二、Vero 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
1.Vero 細(xì)胞在 250 mL 錐形瓶中在 5% CO 2條件置于二氧化碳振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞置于錐形瓶中,CO2搖床中,5% CO 2條件下,37℃培養(yǎng)5天;
2.使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器以及 0.4% 臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)估活細(xì)胞。
3.接下來(lái),將粘附細(xì)胞以1.6×10 5 個(gè)細(xì)胞/m的密度添加到振蕩懸浮培養(yǎng)物中。連續(xù)培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)中的活細(xì)胞,并通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色監(jiān)測(cè)其活力180天。
三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
Ad5 Adv包含在巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子控制下的 GFP 基因。用Vero細(xì)胞進(jìn)行Adv繁殖,然后用TCID 50滴定。為了比較粘附培養(yǎng)系統(tǒng)和懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)之間的Adv產(chǎn)量,將兩種類(lèi)型的 Vero 細(xì)胞接種(以 1.3×10 6 個(gè)細(xì)胞/mL 的密度)在培養(yǎng)皿或錐形瓶中并孵育 5 小時(shí)。然后以0.1的感染復(fù)數(shù)感染細(xì)胞5天。通過(guò)使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度來(lái)確定產(chǎn)生的 Ad5-GFP 的相對(duì)量并使用 GraphPad Prism ver.軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
四、統(tǒng)計(jì)分析
數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。使用 GraphPad Prism ver. 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有 p 值均使用未配對(duì)的雙尾學(xué)生 t 檢驗(yàn) (α=0.05) 在 p<0.001 的顯著性水平上進(jìn)行評(píng)估。
五、Vero細(xì)胞無(wú)血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)驗(yàn)證
為了研究Vero細(xì)胞是否可以在無(wú)血清條件下培養(yǎng),對(duì)Vero細(xì)胞的形態(tài)變化和生長(zhǎng)速率進(jìn)行了VP-SFM、Ultraculture、OptiPRO-SFM、Opti-MEM和SFM4MegaVir測(cè)試。在低血清培養(yǎng)條件下,在 OptiPRO、SFM4MegaVir 或 VP-SFM 中培養(yǎng)的 Vero 細(xì)胞表現(xiàn)出與在常規(guī)培養(yǎng)基(含 10% FBS 的 DMEM)中培養(yǎng)的 Vero 細(xì)胞相似的形態(tài)(圖 1A )). 然而,在 Ultraculture 或 Opti-MEM 中培養(yǎng)的 Vero 細(xì)胞表現(xiàn)出異常形態(tài),例如細(xì)胞聚集,這在常規(guī)培養(yǎng)條件下是觀察不到的。當(dāng)血清濃度從 10% 降低到 0% 時(shí),OptiPRO 培養(yǎng)的 Vero 細(xì)胞在 0% FBS 的初始培養(yǎng)階段生長(zhǎng)速率降低,但與常規(guī)培養(yǎng)條件(DMEM)相比,它們的生長(zhǎng)速率增加并更高在 0% FBS 中培養(yǎng) 51 天后,含 10% FBS)(圖 1B)。然而,在 VP-SFM 或 SFM4MegaVir 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 Vero 細(xì)胞的生長(zhǎng)速率低于在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的 Vero 細(xì)胞??偟膩?lái)說(shuō),使用 OptiPRO 無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng) Vero 細(xì)胞時(shí)不會(huì)發(fā)生形態(tài)變化和生長(zhǎng)速率下降。
圖 1
(A) 在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)的 Vero 細(xì)胞形態(tài)。藍(lán)色和紅色箭頭代表異常的細(xì)胞生長(zhǎng)。(B) 與在含有 10% FBS 的 DMEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞(對(duì)照;藍(lán)線)相比,在無(wú)血清條件下培養(yǎng)的細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。DMEM,Dulbecco 改良的 Eagles 培養(yǎng)基;FBS,胎牛血清。
對(duì)照組實(shí)驗(yàn)
我們測(cè)試了 Vero 細(xì)胞的無(wú)血清條件是否可以應(yīng)用于另一種疫苗株生產(chǎn)細(xì)胞系 MRC-5 和對(duì)照細(xì)胞,即 FRhk-4 細(xì)胞。與在常規(guī)培養(yǎng)基(含有 10% FBS 的 MEM)中培養(yǎng)的細(xì)胞相比,在 SFM4MegaVir Opti-Pro 或 VP-SFM 中培養(yǎng)的所有 MRC-5 細(xì)胞均顯示出異常的細(xì)胞形態(tài),例如細(xì)胞縮短(圖 2A )。在 Opti-MEM、SFM4MegaVir、Opti-Pro、VP-SFM 或 Ultraculture 中培養(yǎng)的 FRhk-4 細(xì)胞未顯示任何異常形態(tài)(圖 2C)). MRC-5 細(xì)胞在 VP-SFM 或 OptiPRO 無(wú)血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率低于在常規(guī)培養(yǎng)基(含 10% FBS 的 MEM)中培養(yǎng)的細(xì)胞,但在 Opti-MEM 或 Ultraculture 培養(yǎng)基中則不然。然而,由于細(xì)胞形態(tài)的變化,在 Opti-MEM 或 Ultraculture 中培養(yǎng)的 MRC-5 細(xì)胞在 8% FBS 下無(wú)法持續(xù)減少(圖 2B)。在 VP-SFM 或 Opti-MEM 中培養(yǎng)的 FRhk-4 細(xì)胞顯示出與在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)期間相似的生長(zhǎng)速率(圖 2D)。
總之,在沒(méi)有 FBS 的情況下,Vero 細(xì)胞的適宜培養(yǎng)條件可能不適用于其他疫苗株生產(chǎn)細(xì)胞,例如 MRC-5 細(xì)胞。
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