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生命科學(xué)研究中常用的幾種實(shí)驗(yàn)方法

 更新時(shí)間:2023-02-06 點(diǎn)擊量:1173

生命科學(xué)研究時(shí)生物學(xué)的分支,下面介紹幾個(gè)關(guān)于生命科學(xué)常用的幾種實(shí)驗(yàn)方法:
一、BCA法測(cè)蛋白質(zhì)濃度

實(shí)驗(yàn)原理:BCA(bicinchoninic acid,二辛可酸)法測(cè)定蛋白質(zhì)即在堿性條件下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合,并將其還原成Cu1+。Cu1+和BCA試劑反應(yīng)使其由原來的蘋果綠形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物,在562 nm有強(qiáng)烈的光吸收,且吸光值和蛋白質(zhì)濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,因此可用于蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。

二、免疫組化

原理:免疫組織化學(xué),即免疫組化,是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理一-抗原抗體反應(yīng),即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、翻、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原《多肽和蛋白質(zhì)),對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。常用于免疫組化實(shí)驗(yàn)的有組織石蠟切片、組織冰凍切片、細(xì)胞爬片或細(xì)胞涂片。

三、RNA提?。═rizol法)

Trizol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚,其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞,促使核蛋白體的解離,使RNA與蛋白質(zhì)分離,并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時(shí),它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相,離心后可形成水相層和有機(jī)層,這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層(無色)主要為RNA,有機(jī)層(黃色)主要為DNA和蛋白質(zhì)。

四、RT-PCR

RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA,再以cDNA為模板,擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中,每一步都在最佳條件下進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)步驟主要包括:1、RNA的提??;2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;3、PCR擴(kuò)增;4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測(cè)定。

五、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q—PCR)(Real-time Quantitative PCR )

利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。

閾值:是循環(huán)開始3~15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍,設(shè)定在擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期。

C(t)值:熒光信號(hào)(擴(kuò)增產(chǎn)物)到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。
 

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