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酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)類型

 更新時間:2023-01-29 點(diǎn)擊量:899

酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) 被稱為免疫測定金標(biāo)準(zhǔn)。是一種免疫學(xué)測定方法,這種測試一般較為靈敏,通常用于檢測和量化物質(zhì),包括抗體、抗原、蛋白質(zhì)、糖蛋白和激素。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)也常用于診斷 HIV 感染、妊娠試驗(yàn)和血型鑒定等。堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶和β-半乳糖苷酶是ELISA中很少使用的酶。

ELISA 在原理上類似于放射免疫測定 (RIA),但更安全且成本較低。
ELISA 有助于抗原或抗體的定性(存在或不存在)和定量(濃度)測量。
當(dāng)前使用的酶聯(lián)免疫分析技術(shù)主要有以下幾種:
1.直接ELISA
直接和間接 ELISA 都從將抗原包被到 ELISA 板上開始。
步驟:
  •   將抗原添加到板中,在 37 攝氏度下孵育一小時或在 4 攝氏度下孵育過夜。

  •   孵育步驟完成后,下一步是清洗任何潛在未結(jié)合抗體的板,并使用 BSA、卵清蛋白、抑肽酶或其他動物蛋白等試劑封閉 ELISA 板上任何未結(jié)合的位點(diǎn)。

  •   這一步很重要,因?yàn)樗梢苑乐谷魏畏翘禺愋钥贵w與板結(jié)合,并盡可能地減少假陽性結(jié)果。添加緩沖液后,重新洗滌板,并添加選定的 酶聯(lián)檢測一抗 。將板進(jìn)一步溫育一小時。

  •   在直接 ELISA 中,主要檢測抗體直接與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合。

  •   接下來,重新洗滌板以去除任何未結(jié)合的抗體,然后向板中添加底物/發(fā)色團(tuán),例如堿性磷酸酶 (AP) 或辣根過氧化物酶 (HRP),從而導(dǎo)致顏色變化。樣品的顏色變化是通過 AP 從底物中水解磷酸基團(tuán)或通過 HRP 氧化底物而發(fā)生的。

  使用直接 ELISA 的優(yōu)勢主要是消除二抗交叉反應(yīng),并且由于步驟更少,與間接 ELISA 相比速度更快。它的缺點(diǎn)包括與其他類型的 ELISA 相比靈敏度低,反應(yīng)成本高。

2. 間接 ELISA
    間接 ELISA 的步驟與直接 ELISA 相同,除了額外的洗滌步驟和去除緩沖液后添加的抗體類型。間接 ELISA 需要兩種抗體,一種是粘附在目的蛋白上的檢測一抗,另一種是與一抗互補(bǔ)的酶聯(lián)二抗。
    開始需要加入一抗,然后進(jìn)行洗滌步驟,再加入酶聯(lián)二抗并孵育。此后,步驟與直接 ELISA 相同,包括洗滌步驟、添加底物和檢測顏色變化。
簡要步驟如下:
  • 將含有一抗 (Ab1) 的樣品添加到抗原包被的微量滴定孔中,然后附著在孔中的抗原與 Ab1 發(fā)生反應(yīng)。

  • 未結(jié)合或游離的 Ab1 都被洗掉,酶標(biāo)二級抗體 (Ab2) 被添加到微量滴定孔中。

  • 與酶偶聯(lián)的二抗與一抗結(jié)合。

  • 游離或未結(jié)合的 Ab2 都被洗掉,并添加酶的特定底物。

  • 形成的有色反應(yīng)產(chǎn)物的量的測定主要由紫外分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、微孔板讀板機(jī)等儀器來完成。

       間接 ELISA法也常用于檢測血清中是否存在抗 HIV 抗體。與直接 ELISA 相比,間接 ELISA 具有較高的靈敏度,反應(yīng)成本較低,這種類型的 ELISA 的主要缺點(diǎn)是二級檢測抗體之間存在交叉反應(yīng)的風(fēng)險。 
3.  酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)-夾心式elisa
與直接和間接 ELISA 不同,夾心 ELISA 從包被到板孔上的捕獲抗體開始。因?yàn)榭乖瓓A在兩層抗體(捕獲抗體和檢測抗體)之間,所以也稱為“三明治"。
   流程如下:將捕獲抗體添加到板中后,將板蓋上并在 4°C 下孵育過夜。包被步驟完成后,用 PBS 清洗板,然后用 BSA緩沖/封閉。緩沖液洗滌在室溫下進(jìn)行至少 1-2 小時。末了,在加入抗原之前用PBS再次洗滌板。
   然后將目標(biāo)抗原添加到板中以與捕獲抗體結(jié)合并在 37 攝氏度下孵育 90 分鐘。重新清洗板,然后將檢測一抗添加到板中并再孵育 1 至 2 小時在室溫下,然后用緩沖液清洗。然后加入酶聯(lián)二抗,再孵育 1 至 2 小時。重新清洗板,加入底物以產(chǎn)生顏色變化。夾心 ELISA 在所有 ELISA 類型中具有具有較高的靈敏度。夾心式elisa 的主要缺點(diǎn)是會耗費(fèi)較多的時間和費(fèi)用,另外這種ELISA 方法,必須要使用配對的抗原(二價/多價抗原)和二抗。
簡略步驟如下:
  • 使用夾心式elisa,抗體被固定在微量滴定孔中,而不是抗原。

  • 添加含有待檢測或測量的抗原的樣品并使其與固定化抗體反應(yīng)。

  • 清洗孔并加入對抗原上不同表位具有特異性的第二種酶聯(lián)抗體,并使其與結(jié)合的抗原反應(yīng)。

  • 通過洗滌去除任何游離的二抗后,加入酶特異性底物。

  • 這稱為夾心 ELISA,因?yàn)榇龣z測的抗原夾在兩種抗體(結(jié)合抗體和酶聯(lián)抗體)之間。

  • 末了,通過分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀等實(shí)驗(yàn)室儀器使用分光光度法來測定有色反應(yīng)產(chǎn)物。

4. 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)-競爭性 ELISA
  競爭性 ELISA方法主要用于檢測血清中是否具有特異性的抗原/抗體。這種類型的 ELISA 會使用兩種特異性抗體,一種酶聯(lián)抗體和另一種存在于測試血清中的抗體(如果血清呈陽性)。將兩種抗體結(jié)合到孔中將允許競爭結(jié)合抗原。顏色變化的存在意味著測試是陰性的,因?yàn)槊附Y(jié)合抗體結(jié)合了抗原(而不是測試血清的抗體)。沒有顏色表明測試呈陽性,并且測試血清中存在抗體。
     該技術(shù)中,需要將抗體與溶液形式的抗原(在樣品中)一起孵育,然后將該混合物添加到抗原包被的微量滴定孔中。樣品中存在的抗原越多,可用于結(jié)合抗原包被孔的游離抗體就越少。添加對一抗同種型具有特異性的酶偶聯(lián)二抗 (Ab2) ,用于確定與孔結(jié)合的一抗數(shù)量,如在間接 ELISA 中一樣。
    競爭性 ELISA 特異性低,不能用于稀釋樣品。然而,好處是需要的樣品純化較少,它可以測量給定樣品中的大范圍抗原,可用于小抗原。然而,需要注意的是在該技術(shù)中,原始樣品中抗原的濃度越高,吸光度越低。 

 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ELISA的應(yīng)用:
1.檢測和測量給定樣品中的抗原或抗體。(自身抗體:抗 dsDNA、抗 dsg1、ANA 等;傳染病抗體:抗菌、抗病毒、抗真菌;甲型、乙型、丙型肝炎、艾滋病毒等)
2.檢測和估計(jì)腫瘤標(biāo)志物的水平:比如:前列腺特異性抗原 (PSA)、癌胚抗原 (CEA)
  • 檢測食品樣品中的潛在過敏原。

  • 用于某些類別藥物的快速推定篩選。

  • 肽、抗體、激素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的檢測和定量

  • 外泌體檢測、細(xì)胞外囊泡檢測等

 影響酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA結(jié)果的因素有哪些?
主要包括檢測板、包被緩沖液、捕獲抗體、封閉緩沖液、靶抗原、檢測抗體、酶偶聯(lián)物、洗滌液、底物、信號檢測的質(zhì)量和完整性都會干擾正確的 ELISA 測試。一些可能干擾測試的因素如下:
1.微孔板:孔的形狀和質(zhì)量、板的材料、潛在的預(yù)激活、均勻或不均勻的涂層
2.緩沖液:pH、污染
3.捕獲和檢測抗體:孵育時間、溫度、特異性、滴度、親和力
4.封閉緩沖液:交叉反應(yīng)、濃度、污染
5.靶抗原:構(gòu)象、穩(wěn)定性、表位
6.酶結(jié)合物:類型、濃度、功能、交叉反應(yīng)
7.清洗:污染、頻率、體積、持續(xù)時間、成分
8.基板:微孔板的質(zhì)量、材質(zhì)
9.檢測:檢測相關(guān)的儀器設(shè)備:比如:分光光度計(jì)、讀板機(jī)等相關(guān)因素
10. 誤差:人為誤差(實(shí)驗(yàn)步驟不規(guī)范等)
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