酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) 被稱為免疫測定金標(biāo)準(zhǔn)。是一種免疫學(xué)測定方法，這種測試一般較為靈敏，通常用于檢測和量化物質(zhì)，包括抗體、抗原、蛋白質(zhì)、糖蛋白和激素。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)也常用于診斷 HIV 感染、妊娠試驗(yàn)和血型鑒定等。堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶和β-半乳糖苷酶是ELISA中很少使用的酶。
ELISA 在原理上類似于放射免疫測定 (RIA)，但更安全且成本較低。
ELISA 有助于抗原或抗體的定性（存在或不存在）和定量（濃度）測量。
當(dāng)前使用的酶聯(lián)免疫分析技術(shù)主要有以下幾種：
1.直接ELISA
直接和間接 ELISA 都從將抗原包被到 ELISA 板上開始。
步驟：
將抗原添加到板中，在 37 攝氏度下孵育一小時(shí)或在 4 攝氏度下孵育過夜。
孵育步驟完成后，下一步是清洗任何潛在未結(jié)合抗體的板，并使用 BSA、卵清蛋白、抑肽酶或其他動物蛋白等試劑封閉 ELISA 板上任何未結(jié)合的位點(diǎn)。
這一步很重要，因?yàn)樗梢苑乐谷魏畏翘禺愋钥贵w與板結(jié)合，并盡可能地減少假陽性結(jié)果。添加緩沖液后，重新洗滌板，并添加選定的 酶聯(lián)檢測一抗 。將板進(jìn)一步溫育一小時(shí)。
在直接 ELISA 中，主要檢測抗體直接與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合。
接下來，重新洗滌板以去除任何未結(jié)合的抗體，然后向板中添加底物/發(fā)色團(tuán)，例如堿性磷酸酶 (AP) 或辣根過氧化物酶 (HRP)，從而導(dǎo)致顏色變化。樣品的顏色變化是通過 AP 從底物中水解磷酸基團(tuán)或通過 HRP 氧化底物而發(fā)生的。
使用直接 ELISA 的優(yōu)勢主要是消除二抗交叉反應(yīng)，并且由于步驟更少，與間接 ELISA 相比速度更快。它的缺點(diǎn)包括與其他類型的 ELISA 相比靈敏度低，反應(yīng)成本高。
2. 間接 ELISA
間接 ELISA 的步驟與直接 ELISA 相同，除了額外的洗滌步驟和去除緩沖液后添加的抗體類型。間接 ELISA 需要兩種抗體，一種是粘附在目的蛋白上的檢測一抗，另一種是與一抗互補(bǔ)的酶聯(lián)二抗。
開始需要加入一抗，然后進(jìn)行洗滌步驟，再加入酶聯(lián)二抗并孵育。此后，步驟與直接 ELISA 相同，包括洗滌步驟、添加底物和檢測顏色變化。
簡要步驟如下：
將含有一抗 (Ab1) 的樣品添加到抗原包被的微量滴定孔中，然后附著在孔中的抗原與 Ab1 發(fā)生反應(yīng)。
未結(jié)合或游離的 Ab1 都被洗掉，酶標(biāo)二級抗體 (Ab2) 被添加到微量滴定孔中。
與酶偶聯(lián)的二抗與一抗結(jié)合。
游離或未結(jié)合的 Ab2 都被洗掉，并添加酶的特定底物。
形成的有色反應(yīng)產(chǎn)物的量的測定主要由紫外分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、微孔板讀板機(jī)等儀器來完成。
間接 ELISA法也常用于檢測血清中是否存在抗 HIV 抗體。與直接 ELISA 相比，間接 ELISA 具有較高的靈敏度，反應(yīng)成本較低，這種類型的 ELISA 的主要缺點(diǎn)是二級檢測抗體之間存在交叉反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。
3. 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)-夾心式elisa
與直接和間接 ELISA 不同，夾心 ELISA 從包被到板孔上的捕獲抗體開始。因?yàn)榭乖瓓A在兩層抗體（捕獲抗體和檢測抗體）之間，所以也稱為“三明治"。
流程如下：將捕獲抗體添加到板中后，將板蓋上并在 4°C 下孵育過夜。包被步驟完成后，用 PBS 清洗板，然后用 BSA緩沖/封閉。緩沖液洗滌在室溫下進(jìn)行至少 1-2 小時(shí)。末了，在加入抗原之前用PBS再次洗滌板。
然后將目標(biāo)抗原添加到板中以與捕獲抗體結(jié)合并在 37 攝氏度下孵育 90 分鐘。重新清洗板，然后將檢測一抗添加到板中并再孵育 1 至 2 小時(shí)在室溫下，然后用緩沖液清洗。然后加入酶聯(lián)二抗，再孵育 1 至 2 小時(shí)。重新清洗板，加入底物以產(chǎn)生顏色變化。夾心 ELISA 在所有 ELISA 類型中具有具有較高的靈敏度。夾心式elisa 的主要缺點(diǎn)是會耗費(fèi)較多的時(shí)間和費(fèi)用，另外這種ELISA 方法，必須要使用配對的抗原（二價(jià)/多價(jià)抗原）和二抗。
簡略步驟如下：
使用夾心式elisa，抗體被固定在微量滴定孔中，而不是抗原。
添加含有待檢測或測量的抗原的樣品并使其與固定化抗體反應(yīng)。
清洗孔并加入對抗原上不同表位具有特異性的第二種酶聯(lián)抗體，并使其與結(jié)合的抗原反應(yīng)。
通過洗滌去除任何游離的二抗后，加入酶特異性底物。
這稱為夾心 ELISA，因?yàn)榇龣z測的抗原夾在兩種抗體（結(jié)合抗體和酶聯(lián)抗體）之間。
末了，通過分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀等實(shí)驗(yàn)室儀器使用分光光度法來測定有色反應(yīng)產(chǎn)物。
4. 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)-競爭性 ELISA
競爭性 ELISA方法主要用于檢測血清中是否具有特異性的抗原/抗體。這種類型的 ELISA 會使用兩種特異性抗體，一種酶聯(lián)抗體和另一種存在于測試血清中的抗體（如果血清呈陽性）。將兩種抗體結(jié)合到孔中將允許競爭結(jié)合抗原。顏色變化的存在意味著測試是陰性的，因?yàn)槊附Y(jié)合抗體結(jié)合了抗原（而不是測試血清的抗體）。沒有顏色表明測試呈陽性，并且測試血清中存在抗體。
該技術(shù)中，需要將抗體與溶液形式的抗原（在樣品中）一起孵育，然后將該混合物添加到抗原包被的微量滴定孔中。樣品中存在的抗原越多，可用于結(jié)合抗原包被孔的游離抗體就越少。添加對一抗同種型具有特異性的酶偶聯(lián)二抗 (Ab2) ，用于確定與孔結(jié)合的一抗數(shù)量，如在間接 ELISA 中一樣。
競爭性 ELISA 特異性低，不能用于稀釋樣品。然而，好處是需要的樣品純化較少，它可以測量給定樣品中的大范圍抗原，可用于小抗原。然而，需要注意的是在該技術(shù)中，原始樣品中抗原的濃度越高，吸光度越低。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ELISA的應(yīng)用：
1.檢測和測量給定樣品中的抗原或抗體。（自身抗體：抗 dsDNA、抗 dsg1、ANA 等；傳染病抗體：抗菌、抗病毒、抗真菌；甲型、乙型、丙型肝炎、艾滋病毒等）
2.檢測和估計(jì)腫瘤標(biāo)志物的水平：比如：前列腺特異性抗原 (PSA)、癌胚抗原 (CEA)
影響酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA結(jié)果的因素有哪些？
主要包括檢測板、包被緩沖液、捕獲抗體、封閉緩沖液、靶抗原、檢測抗體、酶偶聯(lián)物、洗滌液、底物、信號檢測的質(zhì)量和完整性都會干擾正確的 ELISA 測試。一些可能干擾測試的因素如下：
1.微孔板：孔的形狀和質(zhì)量、板的材料、潛在的預(yù)激活、均勻或不均勻的涂層
2.緩沖液：pH、污染
3.捕獲和檢測抗體：孵育時(shí)間、溫度、特異性、滴度、親和力
4.封閉緩沖液：交叉反應(yīng)、濃度、污染
5.靶抗原：構(gòu)象、穩(wěn)定性、表位
6.酶結(jié)合物：類型、濃度、功能、交叉反應(yīng)
7.清洗：污染、頻率、體積、持續(xù)時(shí)間、成分
8.基板：微孔板的質(zhì)量、材質(zhì)
9.檢測：檢測相關(guān)的儀器設(shè)備：比如：分光光度計(jì)、讀板機(jī)等相關(guān)因素
10. 誤差：人為誤差（實(shí)驗(yàn)步驟不規(guī)范等）
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