細(xì)胞外泌體來源和外泌體的表征方法

細(xì)胞外泌體來源及表征方法

細(xì)胞外泌體是直徑為 30-150 nm 的血管外囊泡亞群。在過去的20年里，科學(xué)家已經(jīng)從包括正常細(xì)胞和癌細(xì)胞在內(nèi)的許多細(xì)胞類型中分離出外泌體，并且研究了它們對其他細(xì)胞的影響。外泌體是由多種大分子組成，例如核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。

細(xì)胞外泌體具有天然的特定細(xì)胞靶向特性，通常被設(shè)計用于靶向大分子（DNA 和 RNA）和藥物遞送系統(tǒng)（多柔比星、紫杉醇和紫杉醇）。目前常用細(xì)胞外泌體的分離方法主要是超速離心法、密度梯度離心法、超濾分離法、基于聚合物的沉淀法、親和沉淀分離法、  免疫磁珠法和色譜法等

一、外泌體來源及其釋放途徑
外泌體在人體的主要作用是充當(dāng)局部和全身信號和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。外泌體（直徑 30-150 nm）是較小的血管外囊泡亞群，它的還包括微泡（50 nm-1 μ m）和凋亡小體（ 50 nm-5 μm）。

外泌體的來源是內(nèi)體系統(tǒng)。由內(nèi)膜出芽形成早期核內(nèi)體，早期內(nèi)體可以與內(nèi)吞小泡融合，從而引導(dǎo)它們的貨物進(jìn)行回收、降解或分泌。當(dāng)早期內(nèi)體成熟為晚期內(nèi)體時，在它們成熟為晚期核內(nèi)體的過程中，囊泡膜向內(nèi)出芽，導(dǎo)致多泡體 (MVB) 的產(chǎn)生，其中包含許多腔內(nèi)囊泡 (ILV).  在此階段，MVB 可以與溶酶體融合（ILV 繼續(xù)降解）或與質(zhì)膜融合，導(dǎo)致 ILV  釋放到細(xì)胞外空間。這些釋放的 ILV 稱為外泌體，包含著許多源自細(xì)胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和多糖 。 另一種釋放機(jī)制就是由于質(zhì)膜向外出芽，從而導(dǎo)致形成所謂的脫落微泡或外泌體 。
 
二、 外泌體的表征方法
根據(jù)藥物遞送系統(tǒng) (DDS) 表征外泌體結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，因?yàn)樗鼪Q定了 DDS 的特性，例如細(xì)胞或組織親和力、應(yīng)激反應(yīng)、吸收途徑和藥物釋放。 2014  年和 2018 年國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會 (MISEV2018) 提出了外泌體（包括研究和外泌體制備）應(yīng)滿足的基本要求指南。在開發(fā)基于外泌體的  DDS 時，必須考慮數(shù)量、大小、形態(tài)、膜組成和蛋白質(zhì)（包括受體）等參數(shù)。這些參數(shù)表征所用的技術(shù)主要為光學(xué)、非光學(xué)和微流體技術(shù)。

1.光學(xué)方法
目前，光學(xué)方法是外泌體表征的主要方法，即動態(tài)光散射 (DLS)、多角度光散射 (MALS) 和納米粒子跟蹤分析 (NTA)  。這些方法允許對尺寸（DLS 0.5–200 nm；MALS 10 –500 nm；NTA 10–1000 nm ）、尺寸分布和濃度進(jìn)行高分辨率測量。 DLS 和 MALS 的結(jié)合增加了測量范圍 (0.5–500 nm)  和精度。光學(xué)方法比較受歡迎的，但缺點(diǎn)是靈敏度低、試劑消耗高以及需要昂貴的設(shè)備。
在使用 納米粒子跟蹤分析NTA 方法過程中，熒光染料的加入也提高了分辨率，并允許通過使用熒光標(biāo)記來表征表面免疫表型。從而確定標(biāo)記物存在。

2.非光學(xué)方法
非光學(xué)方法主要包括掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）、冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM  ）、原子力顯微鏡（AFM）、免疫檢測方法（ELISA）、傅立葉變換紅外光譜（FTIR  ）、可調(diào)諧電阻脈沖傳感 (TRPS) 和單粒子干涉反射成像傳感器 (SP-  IRIS ) 。 SEM、TEM 和 AFM 方法通常用于直接膜結(jié)構(gòu)和形態(tài)測定，而  ELISA 檢測提供各種結(jié)構(gòu)顆粒（主要是蛋白質(zhì)和受體）的檢測和量化，例如，用于外泌體形態(tài)的 確認(rèn)。
   
FTIR 光譜和衰減全反射 FTIR (ATR-FTIR) 常用于外泌體質(zhì)量量化和脂質(zhì)和蛋白質(zhì)含量的總體估計。使用 TRPS  ，可以同時測量大小、濃度和 zeta 電位。由于掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡的成本較高，近些年來，一種新型的納米粒度分析儀器在外泌體研究領(lǐng)域迅速發(fā)展，比如 Nanocoulter粒度分析儀可以不僅可以進(jìn)行 單顆粒檢測，顆粒粒徑檢測還可以檢測細(xì)胞外泌體的濃度、zeta電位、形態(tài)等進(jìn)行多維度檢測。

單粒子干涉反射成像傳感器 (SP-IRIS) 也用于外泌體定量，但也可用于檢測特定標(biāo)記物和確定外泌體亞群. 

3.微流體分析技術(shù)
微流體技術(shù)在外泌體研究方面也起著推動作用。微流體技術(shù)不僅提供了高質(zhì)量、高特異性的數(shù)據(jù)，并且試劑消耗量低，通量高. 

基于微流體技術(shù)的研究方法需要結(jié)合使用微流控芯片，微流控芯片通常由玻璃基和聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 膜制成，包含許多尺寸適合所分析樣品的微通道。主要區(qū)別在于芯片的內(nèi)表面，可以通過多種方式對其進(jìn)行功能化，例如通過涂層、多層沉積、電沉積和  蝕刻. 目前研究中針對不同的微流控表征方法，也制造了不同類型的微芯片，包括免疫芯片、磁性芯片和電化學(xué)芯片。

外泌體及其蛋白質(zhì)也可以通過比色法（標(biāo)記抗體/ELISA）、直接熒光染色（ DiO 染料）  、電化學(xué) 性質(zhì)變化和光學(xué)方法進(jìn)行檢測。對于結(jié)果評估，還需要額外的設(shè)備，例如讀板器或熒光顯微鏡等.

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