Western，也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，常簡寫為WB，是用抗體檢測蛋白表達(dá)的重要方法之一。碧云天試劑總結(jié)Western實驗步驟可如下進(jìn)行操作。
1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
根據(jù)實驗需要，使用適當(dāng)?shù)牧呀庖?/span>，例如碧云天生產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013/ P0013J)、RIPA裂解液(P0013B/ P0013C/
P0013D/ P0013K)、 NP-40裂解液(P0013F)或SDS裂解液(P0013G)等，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品；為了防止蛋白的降解，或保證磷酸化或乙酰化蛋白的穩(wěn)定，也可額外添加蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑或去乙酰化酶抑制劑混合物( P1005/ P1006/P1045/ P1046/ P1112/P1113)。對于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提，例如碧云天生產(chǎn)的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒( P0027和P0028)、 細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒(P0033)、 細(xì)胞線粒體分離試劑盒(C3601)、 組織線粒體分離試劑盒(C3606)。
收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用碧云天生產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒( P0009/ P0010/ P0010S/ P0011/ P0012/ P0012S)、 Bradford蛋白濃度測定試劑盒(去垢劑兼容型)(P0006C)。
2.電泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝膠配制
SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制，也可以使用碧云天試劑、天能SDS-PAGE凝膠預(yù)制膠、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(P0012A)、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(P0012AC)。這兩種試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。更方便的，可以使用碧云天的各種濃度規(guī)格的預(yù)制膠產(chǎn)品( P0050/ P0051/P0052/ P0053/ P0055/ P0056/ P0057/ P0058)。
(2) 樣品處理
在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)(P0015)或 SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X) (P0015L)。 如果是非變性樣品，可以使用 非變性PAGE蛋白上樣緩沖液(P0016)或非變性非還原性蛋白上樣緩沖液(P0016N)。
100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。
(3) 上樣與電泳
蛋白樣品冷卻到室溫后，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。
碧云天提供各種預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)用于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小。最好使用彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(P0068/P0069/P0071/P0072/ P0075/P0076/P0077/P0078/P0079/P0080)或預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)( P0066/ P0067)。
電泳時電泳液可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE電泳液(P0014A/P0014B)。
電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可以設(shè)置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求，也可以采用碧云天的多功能電泳儀(帶定時)(EEP102)。為了電泳方便起見，也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V，然后設(shè)定定時時間為90-120分鐘。設(shè)置定時可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過頭。
通常電泳時溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。
3. 轉(zhuǎn)膜(Transfer )
我們推薦在Western實驗中選用PVDF膜(FFP24/FFP26/ FFP28/FFP32/ FFP33/ FFP36/ FFP39),其中推薦使用PVDF膜(進(jìn)口分裝，6.6×8.5cm,0.2μm) ( FFP24/FFP26)。PVDF膜在使用前須經(jīng)浸潤和活化，推薦使用碧云天生產(chǎn)的安全無毒的 PVDF膜浸潤活化液(P0021S)。也可以使用硝酸纖維素膜(NC膜) ( FFN02/ FFN03/FFN05/FFN06/ FFN08)，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。
轉(zhuǎn)膜時推薦使用碧云天生產(chǎn)的高品質(zhì)轉(zhuǎn)印濾紙(7.5×10cm) (FFP51)。 轉(zhuǎn)膜時的溶液推薦使用碧云天的Western轉(zhuǎn)膜液(P0021A/P0021B)。
通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，轉(zhuǎn)膜時間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過夜。轉(zhuǎn)膜時也可以使用碧云天的多功能電泳儀(帶定時)(EEP102)。具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。
在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時，通常會有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量最大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液(P0022)對膜進(jìn)行染色，以觀察實際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液(P0017)對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。
4.封閉(Blocking)
轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先加入Western洗滌液(P0023C/P0023C3/ P0023C6)的Western洗膜盒(FFX050/ FFX052/ FFX055)中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。
用微型臺式真空泵(E0110/E0111/ E0112/E0113/ E0114/ E0115)或滴管等吸盡洗滌液，優(yōu)先推薦加入適量的 QuickBlock™ Western封閉液(P0252)，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉10分鐘；也可以加入 Western封閉液(P0023B)，在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60分鐘。對于一些背景較高的抗體，兩種封閉液都可以適當(dāng)延長封閉時間，如有必要甚至可以4℃封閉過夜。在整個Western過程中我們推薦使用碧云天的 側(cè)擺搖床( E0016-E0030)或類似儀器，側(cè)向擺動速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。
5.一抗孵育(Primary antibody incubation )
參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用QuickBlock™ Western一抗稀釋液(P0256)或Western一抗稀釋液(P0023A)稀釋一抗, ，碧云天提供了近千種 優(yōu)質(zhì)一抗。
用微型臺式真空泵或滴管等吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以4℃緩慢搖動孵育過夜。或更據(jù)抗體的說明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r間。
回收一抗。加入Western洗滌液(P0023C/P0023C3/ P0023C6)，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。
注：Western結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對照，通?？梢赃x用Tubulin抗體(AT819/AF0001)、Actin抗體( AA128/ AF0003)或GAPDH抗體(AG019/ AF0006)，進(jìn)行內(nèi)參檢測。
6. 二抗孵育(Secondary antibody incubation)
參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例用QuickBlock™ Western二抗稀釋液(P0258)或Western二抗稀釋液(P0023D)稀釋辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)等標(biāo)記的二抗。二抗需根據(jù)一抗進(jìn)行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如 辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)。碧云天有 多種二抗提供。
用微型臺式真空泵或滴管等吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。
回收二抗。加入Western洗滌液(P0023C/P0023C3/ P0023C6)，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。
7. 蛋白檢測(Detection of proteins)
參考相關(guān)說明書，使用BeyoECL Star (P0018A)或BeyoECL Plus(P0018)等ECL類試劑來檢測蛋白。壓片可以采用專用的壓片暗盒( FFC58/ FFC83)進(jìn)行。也可以使用DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒( P0202/ P0203)、TMB顯色液(組化或膜HRP顯色用) (P0211)或 BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(C3206)。
洗片時可以使用X光片自動洗片機。如果沒有自動洗片機，可以用顯影定影試劑盒(P0019/P0020)自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。X光片推薦選用原柯達(dá)生產(chǎn)的生物實驗專用X-OMAT BT膠片( FF057/ FF081)。
8. 膜的重復(fù)利用(Membrane recovery )
如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用Western一抗二抗去除液(P0025/P0025B/ P0025N/ P0025S)處理蛋白膜，以重復(fù)利用蛋白膜。
實驗試劑由蘇州阿爾法生物提供。
