Lipofectamine 3000簡稱LIP3000采用了脂質(zhì)體納米微粒技術(shù)，提供了出眾的轉(zhuǎn)染性能和可重復(fù)的結(jié)果。它適用于各種難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和常見的細(xì)胞，在保證轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)也提高了細(xì)胞存活率。 Lipofectamine 3000試劑可以將難轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率提升10倍左右，同時(shí)還可以降低細(xì)胞的死亡率。
另外，LIP 3000還具有多功能性，在某些情況下，它甚至可以取代電穿孔，由于提升了轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的存活率，從而也簡化了工作流程。盡管Lipofectamine 2000十分受歡迎，但對(duì)于某些敏感的細(xì)胞，依然存在細(xì)胞毒性。為此，在Lipofectamine 3000的開發(fā)過程中，科學(xué)家們優(yōu)化了轉(zhuǎn)染過程的四個(gè)步驟，并結(jié)合了先進(jìn)的脂質(zhì)體納米微粒技術(shù)。所以，Lipofectamine 3000減少了試劑的用量，并降低潛在的毒性風(fēng)險(xiǎn)。
LIP3000和LIP2000的區(qū)別是什么？轉(zhuǎn)染效率如何？
通過科學(xué)家使用這兩種試劑來轉(zhuǎn)染來自各種組織的癌細(xì)胞。研究結(jié)果證實(shí)，Lipofectamine 3000試劑的轉(zhuǎn)染性能高于lip2000。使用Lipofectamine 2000，只有25%的癌細(xì)胞系被認(rèn)為是容易轉(zhuǎn)染的（轉(zhuǎn)染效率高于50%），而使用Lipofectamine 3000，這個(gè)比例高達(dá)60%。
此外，Lipofectamine 3000還促進(jìn)了新的技術(shù)，如當(dāng)下流行的基因組編輯。GeneArt TALs和CRISPR靶定了HepG2和U2OS細(xì)胞中的AAVS1位點(diǎn)。采用新的轉(zhuǎn)染試劑后，研究人員發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率、平均熒光強(qiáng)度和基因組切割改善。這些進(jìn)步可實(shí)現(xiàn)更輕松的干細(xì)胞操作，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的位點(diǎn)特異性插入。
什么是脂質(zhì)體？
脂質(zhì)體脂質(zhì)體是類似于細(xì)胞膜的具有高親和力的囊泡，將DNA放入其中（準(zhǔn)確地說，DNA包裹在脂質(zhì)體中）并導(dǎo)入細(xì)胞。大多數(shù)脂質(zhì)體是脂質(zhì)和亞精胺衍生物結(jié)合的類型。我嘗試了 Lipofectamin、Lipofectamin2000、Lip3000、Tlansfectine、Tlansfectum、DMRIEC、SuparFect、Fugen6、Tf-x、Do-fecto，將 Lipofectamin 與試劑結(jié)合使用。現(xiàn)在可以轉(zhuǎn)染大多數(shù)貼壁細(xì)胞系。
脂質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)染過程：
待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)在前一天接種。具體轉(zhuǎn)染步驟如下：
1. 1. 向 Opti-MEM50ul 中加入 DNA 溶液（1ug；即使在引入多個(gè)質(zhì)粒時(shí)也總共 1ug）并混合。
2. 2. 將 Plus Regent (4ul) 添加到 opti-MEM50ul 中并與 1 混合。靜置15分鐘。在此期間，將細(xì)胞更換為無血清培養(yǎng)基（不包括抗生素）。
3. 3. 將 Lipofectoamine (2ul) 添加到 opti-MEM100ul 中并與 2 混合。靜置15分鐘。用顯微鏡強(qiáng)烈放大時(shí)可以觀察到細(xì)顆粒。
4. 用新的 600 ul 無血清培養(yǎng)基更換細(xì)胞培養(yǎng)基。3. 3. 添加脂質(zhì)體并緩慢混合。
5. 2-4 小時(shí)后（2 小時(shí)即可）加入 800 ul 20% 血清培養(yǎng)基。
6. 再過 2-4 小時(shí)后，用 10% 血清培養(yǎng)基（不含抗生素）更換培養(yǎng)基。
（換液隔天重新電鍍）
細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)的注意事項(xiàng)：
盡量使用聚苯乙烯設(shè)備（48孔板方便）。DNA 在小量制備水平上的純化程度較低。將其與 maxi 一起使用并與 CsCl 結(jié)合，或通過用苯酚/氯仿提取 minipresed DNA 并用 EtOH 沉淀來使用它。
2. 或者，如果在步驟 3 中形成了大的團(tuán)塊，那是由于 DNA 純化程度低。如果在轉(zhuǎn)染后的第二天觀察到真菌污染，則主要認(rèn)為是從質(zhì)粒 DNA 或其管中攜帶的。更換10%血清培養(yǎng)基（不含抗生素）后，細(xì)胞在4小時(shí)左右即可恢復(fù)，因此可通過更換10%血清培養(yǎng)基（含抗生素）來防止污染。
3. 通常在轉(zhuǎn)染后24 至 72 小時(shí)觀察到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
4.正常情況下峰值為48小時(shí)，但當(dāng)細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)且細(xì)胞增殖能力高時(shí)，表達(dá)水平會(huì)相對(duì)低于24小時(shí)。在報(bào)告基因檢測中，轉(zhuǎn)染后的第二天，需要將48孔板稀釋1/3至2/3倍并重新鋪展，貼壁培養(yǎng)。正常的核受體配體反應(yīng)在大約 8 到 12 小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)報(bào)告產(chǎn)物。
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