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pcr擴增的原理和具體實驗步驟

 更新時間:2022-07-27 點擊量:3572

pcr擴增的原理和具體實驗步驟

PCR實驗是分子生物學中常見用的實驗之一,在基因擴增、核酸檢測、基因檢測等方面廣泛應用。pcr擴增的原理和步驟如下:

一、試劑準備:
PCR常用的試劑主要包括 DNA 模板、引物、ddH 2 O、 DNA 聚合酶以及特定的反應緩沖液、dNTP、MgSO 4(可選)和 DMSO (可選)。 

二、PCR實驗前的準備
在開始PCR實驗之前,必須準備好DNA模板(基因組DNA 或逆轉(zhuǎn)錄制備的cDNA)、特異性引物(自己設計或用軟件設計),并選擇合適的商業(yè)酶(選擇符合您實驗目的的酶) 

1.DNA聚合酶。有許多商業(yè) DNA 聚合酶,它們具有不同的特性。一般分為兩類:高保真聚合酶和普通Taq 聚合酶。如果您想對沒有任何突變的特定 DNA 片段進行 PCR,請選擇高保真聚合酶。如果只是想檢測特定序列的存在,就選擇普通的 Taq 聚合酶。如果要對T-vector連接的片段進行PCR,要注意 ,因為大多數(shù)高保真聚合酶的產(chǎn)物都沒有 A-tailing,所以應該選擇普通的Taq聚合酶或在PCR 實驗后添加 A-tailing。

2.引物的特異性影響 PCR 成功的概率,良好的引物設計對 PCR 擴增的成功至關重要。當您開始設計引物時,應仔細考慮以下幾個原則:
①引物的長度。PCR引物一般在18-22bp左右。這對于引物特異性和在退火溫度下的結(jié)合來說是足夠長的。
②熔化溫度(Tm)。Tm 定義為在此溫度下,DNA 雙鏈體的一半將解離成單鏈 DNA。52-58C 范圍內(nèi)的引物 Tm 是*佳的。
③GC 含量。*佳 GC 含量應為 40-60%。
④許多軟件可用于引物設計,例如primer5和Oligo。這些軟件推薦的引物通常可以滿足我們的需求。

pcr實驗步驟

三、 pcr實驗步驟:
根據(jù)PCR使用說明進行試劑混合預配,并設置 PCR 循環(huán)。
簡而言之,pcr擴增的原理和步驟需要經(jīng)過以下 循環(huán):
1.初始化步驟。這僅對熱啟動 PCR。此步驟將溶液加熱至 94-98°C ,以激活 DNA 聚合酶。該步驟的時間取決于所使用的聚合酶。
2.變性步驟。DNA是雙鏈分子,DNA擴增需要引物與單鏈 DNA模板相互作用。在此步驟中,將反應混合物加熱至 94-98°C 并保持 20-30 秒,以破壞兩條鏈之間的氫鍵并生成單鏈 DNA 分子。此時進入 PCR 循環(huán)。
3.退火步驟。變性后,反應混合物中的 DNA 模板是單鏈的。由于引物與DNA模板互補,當反應溫度降低到 50-65℃時,引物會與模板序列匹配,互補堿基之間形成氫鍵。退火溫度取決于所用引物的Tm,一般比引物Tm 低 3-5℃左右。該步驟將持續(xù)約 20-40 秒以*退火,然后聚合酶將定位到引物- 模板雜交體以開始 DNA 組裝。
4.伸長步驟。在此步驟中,DNA 聚合酶開始合成 DNA,因此溫度應為 DNA 聚合酶的最適溫度。一般選擇 72°C,但有些酶在 68°C 時效果更好。這一步與體內(nèi) DNA復制非常相似,DNA聚合酶將dNTPs添加到引物中,以 5' 到3'方向與模板互補,最終產(chǎn)生新的雙鏈DNA片段。延伸時間取決于目標 DNA 片段的長度和 DNA 聚合酶的能力。一般來說,DNA 聚合酶每 60 秒產(chǎn)生一千個堿基。
5. 循環(huán)。2~4步稱為一個循環(huán),每循環(huán)一次,目標片段量翻倍。一個 PCR 過程使用 30-35 個循環(huán)。在 PCR 循環(huán)的早期,PCR 產(chǎn)物以指數(shù)速率積累,而在 PCR 循環(huán)的后期,隨著 dNTPs、引物的減少和 DNA 聚合酶在變性溫度下的失活,反應減慢,PCR 速率逐漸下降。
6.終伸長率。30-35個循環(huán)結(jié)束后,在68-74℃的溫度下終延伸約 5-10分鐘,以充分延伸剩余的單鏈DNA。
7.貯存。產(chǎn)品可以在 PCR 機器中維持溫度在 4-10°C。

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