實驗前準(zhǔn)備:
1、瓊脂糖凝膠:瓊脂糖凝膠的配置濃度需要根據(jù)DNA片段長度的大小而定。具體的瓊脂糖凝膠的配置濃度參考范圍如下:
2、緩沖液:核酸的電泳緩沖液主要有有 Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE) 3種。實驗中多選用TBE緩沖液,如果考慮成本因素的話也可以嘗試使用TAE緩沖液。TPE緩沖液磷酸鹽濃度較高,在進行DNA回收時容易形成沉淀。10XTBE緩沖液可以直接購買,也可以自行配制。
10XTBE緩沖液配制方法如下:
Tris:108克
EDTA: 9.3克
硼酸:55克
加純水到1000ul (PH為8.0~8.2之間) ,使用時用20倍的水稀釋到0.5XTBE即可。
3、指示劑的使用
指示劑:在DNA電泳實驗中常用的指示劑主要為溴二甲苯酚藍(lán)和二甲苯青等。堿性環(huán)境下的溴二甲苯酚藍(lán)呈現(xiàn)紫藍(lán)色,在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的遷移速率也不相同。比如:在0.6%濃度的凝膠中的遷移率與1KB長度的DNA片段基本一致。而在1%左右濃度的瓊脂糖凝膠中遷移速率與0.6KB長度的雙鏈DNA片段基本一致。
二甲苯青溶于水呈現(xiàn)藍(lán)色,同樣在濃度不同的凝膠中二甲苯青的遷移速率也是不相同的,比如在1%瓊脂糖凝膠電泳時,其遷移速率大致與2Kb雙鏈DNA接近。
4、染色劑的使用
染色劑:核酸電泳后,需經(jīng)染色后才能顯現(xiàn)出帶型,瓊脂糖凝膠實驗較為常用的是EB染色,也就是溴化乙錠染色法。根據(jù)實際實驗情況,可在凝膠電泳緩沖液中加入濃度為0.5ug/ml的溴化乙錠,或電泳后將凝膠置入濃度為0.5ug/ml EB溶液中染色10-15分鐘。即可看到條帶。值的注意的是EB濃度如果過高會影響到條帶的清晰度。
5、核酸電泳設(shè)備:
核酸電泳設(shè)備主要包括電泳儀、電泳槽、梳子等。
6.核酸電泳方法
(1)在用純水清洗過的電泳槽里放置好梳子。
(2)將稀釋好的0.5xTBE緩沖液加入三角瓶中,并加入定量的瓊脂粉,根據(jù)實驗要求配置好對應(yīng)的瓊脂糖凝膠。待冷卻到60°C時即可加入EB。緩慢倒入電泳槽中凝固。
(3)待膠凝固后,箱電泳槽中緩緩加入0.5XBE濃度的TBE,加入量以淹沒膠面2MM為宜。
(4)打開電源,進行電泳操作。
(5)根據(jù)電泳條帶進行電泳分析比對。
蘇州阿爾法生物所提供的天能系列SDS-PAGE 、蛋白電泳預(yù)制膠、梯度預(yù)制膠、電泳儀、電泳槽、核酸電泳預(yù)制膠、核酸電泳儀、電泳儀電源、電泳槽等實驗室設(shè)備。