活細(xì)胞成像系統(tǒng)對(duì)顯微鏡的要求

   在設(shè)計(jì)用于活細(xì)胞成像研究的光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)時(shí)，主要考慮因素是檢測(cè)器靈敏度（信噪比）、所需的圖像采集速度和樣本活力。在使用活細(xì)胞時(shí)，必須嚴(yán)格避免在記錄固定細(xì)胞和組織的圖像時(shí)通常使用的相對(duì)較高的光強(qiáng)度和較長(zhǎng)的曝光時(shí)間（其中光漂白是主要考慮因素）。幾乎在所有情況下，活細(xì)胞顯微鏡都代表了實(shí)現(xiàn)較佳圖像質(zhì)量和保持細(xì)胞健康之間的折衷。
   原則上，理想的活細(xì)胞圖像采集系統(tǒng)應(yīng)該足夠靈敏，可以從弱熒光標(biāo)本中采集優(yōu)質(zhì)圖像，同時(shí)足夠快以記錄所有動(dòng)態(tài)過(guò)程。此外，該系統(tǒng)將具有足夠的分辨率來(lái)捕捉精細(xì)的樣本細(xì)節(jié)和能夠準(zhǔn)確測(cè)量微小的強(qiáng)度差異的寬動(dòng)態(tài)范圍。但是，如果優(yōu)化這些標(biāo)準(zhǔn)中的任何一個(gè)都是以犧牲其他標(biāo)準(zhǔn)為代價(jià)的。因此，目前不可能設(shè)計(jì)出適合所有可能研究范圍的通用活細(xì)胞成像系統(tǒng)。反而，研究人員必須通過(guò)確定較重要的優(yōu)化參數(shù)來(lái)做出妥協(xié)，同時(shí)仍然試圖限制那些被認(rèn)為不太感興趣的變量所做出的犧牲。較后，顯微鏡配置較終取決于成像模式的要求、在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持標(biāo)本活力的必要性、標(biāo)記協(xié)議的難度級(jí)別以及設(shè)備的可用性。

活細(xì)胞成像技術(shù)
活細(xì)胞成像是在光學(xué)顯微鏡中使用廣泛的對(duì)比度增強(qiáng)成像模式進(jìn)行的。大多數(shù)研究涉及某種形式的熒光顯微鏡，通常與一種或多種透射光技術(shù)相結(jié)合。比如：熒光技術(shù)包括傳統(tǒng)的寬場(chǎng)落射熒光、激光掃描共聚焦、旋轉(zhuǎn)盤(pán)和掃場(chǎng)共聚焦、多光子、全內(nèi)反射 ( TIRF )、熒光相關(guān)光譜、壽命成像 ( FLIM )、光活化和激光捕獲。作為一個(gè)子集，它包含：光譜成像、多色成像、共定位、延時(shí)序列、光漂白恢復(fù)技術(shù)（FRAP、FLIP和FLAP)、共振能量轉(zhuǎn)移 ( FRET )、散斑顯微鏡 ( FSM ) 和膜片鉗通常與一種或多種主要成像模式耦合。熒光技術(shù)可以輔以傳統(tǒng)的明場(chǎng)模式，包括微分干涉對(duì)比 ( DIC )、霍夫曼調(diào)制對(duì)比 ( HMC)) 和相位對(duì)比，作為熒光探針定位的確認(rèn)。在幾乎所有情況下，每種顯微鏡配置都需要一些*的考慮因素，這些因素必須實(shí)施才能成功進(jìn)行活細(xì)胞成像。無(wú)論采用何種顯微鏡和數(shù)碼相機(jī)系統(tǒng)對(duì)活細(xì)胞和組織進(jìn)行成像，兩個(gè)較重要和限制因素是維持細(xì)胞活力和實(shí)現(xiàn)高于背景噪聲和自發(fā)熒光的可能信號(hào)水平。
活細(xì)胞成像中的信噪比
      固定細(xì)胞成像和活細(xì)胞成像之間的根本區(qū)是：固定細(xì)胞成像為研究人員提供了足夠的空間來(lái)定義圖像采集參數(shù)，例如定位合適的視場(chǎng)和確定曝光時(shí)間，以及調(diào)整電子增益設(shè)置、讀出率和偏移值。因此，在大多數(shù)情況下（使用充分染色的固定標(biāo)本）可以獲得利用相機(jī)系統(tǒng)的全動(dòng)態(tài)范圍的圖像，從而產(chǎn)生較佳的信噪比。由于維持細(xì)胞活力的嚴(yán)格要求對(duì)成像參數(shù)的限制，活細(xì)胞的情況會(huì)有所不同。對(duì)于獲得的活細(xì)胞圖像，樣本的強(qiáng)度通常只比背景的強(qiáng)度高幾個(gè)灰度級(jí)。在這種情況下，探測(cè)器系統(tǒng)的暗電流和讀取噪聲水平成為細(xì)胞成像所必要考慮的條件。  經(jīng)濟(jì)型相機(jī)通常具有較高的噪聲水平，這樣會(huì)導(dǎo)致背景圖像不太均勻，通常會(huì)掩蓋來(lái)自樣本的信號(hào)，隨著讀出速度的提高，這種影響會(huì)變得更加嚴(yán)重。所以在幾乎所有活細(xì)胞成像應(yīng)用中，檢測(cè)器的選擇對(duì)于決定實(shí)驗(yàn)的成敗至關(guān)重要。
其實(shí)，數(shù)字成像中的四個(gè)主要噪聲源來(lái)自探測(cè)器、照明系統(tǒng)、泊松噪聲或散粒噪聲（由于光子通量的隨機(jī)性）和雜散光。在大多數(shù)情況下，可以通過(guò)仔細(xì)選擇檢測(cè)器和優(yōu)化照明條件來(lái)系統(tǒng)地降低噪聲。幾乎每種類(lèi)型的光子探測(cè)器都會(huì)在設(shè)備記錄的每次測(cè)量中引入某種形式的噪聲。激光掃描和多光子顯微鏡中使用的光電倍增管可以在信號(hào)放大系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生雜散電子。
為了克服傳統(tǒng)高性能 CCD 相機(jī)在需要在極低光照水平下快速捕捉幀速率的應(yīng)用的缺點(diǎn)，制造商推出了一種創(chuàng)新方法，用于放大 CCD 讀取本底噪聲以上的微弱信號(hào)。通過(guò)集成片上倍增增益寄存器，電子倍增器件 ( EMCCD ) 以低得多的成本實(shí)現(xiàn)了增強(qiáng)型或電子轟擊 CCD 典型的單光子檢測(cè)靈敏度，并且不會(huì)影響傳統(tǒng) CCD 架構(gòu)的量子效率和分辨率特性。 
活細(xì)胞成像對(duì)細(xì)胞顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的要求
      針對(duì)活細(xì)胞成像應(yīng)用的顯微鏡必須配備由堅(jiān)固的復(fù)合材料或鋁制成的高質(zhì)量框架，并且應(yīng)該通過(guò)牢固地安裝在無(wú)振動(dòng)平臺(tái)上來(lái)穩(wěn)定。外部光學(xué)表面以及組件外殼（聚光鏡、燈箱、物鏡轉(zhuǎn)盤(pán)等）應(yīng)保持清潔狀態(tài)，顯微鏡周?chē)沫h(huán)境應(yīng)無(wú)塵且相對(duì)濕度較低?；罴?xì)胞成像持續(xù)需要的常規(guī)程序之一是使用科勒照明原理確保顯微鏡光學(xué)路徑和光闌對(duì)齊。
     活細(xì)胞成像較關(guān)鍵的方面可能是實(shí)現(xiàn)較佳放大倍率，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中平衡信號(hào)強(qiáng)度（有利于低倍率）、分辨率（有利于更高倍率）和細(xì)胞活力。研究人員使用時(shí)注意用盡可能少的透鏡元件將光學(xué)放大倍率與探測(cè)器的像素大小相匹配。具有多種中間放大倍數(shù)的光耦合器可在市場(chǎng)上買(mǎi)到，以滿(mǎn)足光限制和高分辨率應(yīng)用的特定物鏡要求（放大倍率和數(shù)值孔徑）。在選擇顯微鏡物鏡放大倍率時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格考慮奈奎斯特分辨率標(biāo)準(zhǔn)。

      活細(xì)胞成像常用的標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡物鏡是 10x 和 40x（干），以及 40x、60x 和 100x 油浸或水浸版本。經(jīng)濟(jì)的干式低倍率鏡頭主要用于樣品的初步掃描以定位感興趣的區(qū)域，并且不需要高光學(xué)校正因子。而浸沒(méi)透鏡應(yīng)具有高數(shù)值孔徑（油為 1.3 至 1.45，水為 1.2）和高透光效率。由于圖像通常聚集在視場(chǎng)中心附近，因此高度校正以產(chǎn)生平坦視場(chǎng)的物鏡通常不會(huì)提供可檢測(cè)的好處，并且與校正較少的物鏡相比，成本明顯更高且光效更低。
           冷卻單色 sCMOS 和 CCD 相機(jī)是大多數(shù)涉及培養(yǎng)中活細(xì)胞的成像應(yīng)用的適宜選擇，無(wú)論是落射熒光還是具有對(duì)比度增強(qiáng)（DIC 和相差）的透射光是主要采集模式。在選擇相機(jī)時(shí)，要考慮的重要參數(shù)包括量子效率、噪聲水平（暗電流和讀數(shù)）、像素大小（以及相關(guān)的全阱容量）和掃描頻率。為了盡量減少撞擊樣品的激發(fā)光水平，相機(jī)應(yīng)盡可能靈敏，這通常意味著高量子效率、低噪聲、大像素尺寸和慢掃描速率。

      慢掃描 CCD 相機(jī)的幀速率通常受到限制，除非樣品具有極亮的熒光，否則當(dāng)曝光時(shí)間短時(shí)信噪比會(huì)差。這限制了這些相機(jī)系統(tǒng)在高速成像應(yīng)用中的使用（范圍高達(dá)每秒 30 幀），并阻礙了對(duì)樣本進(jìn)行聚焦的嘗試。在定位合適的標(biāo)本和聚焦相機(jī)時(shí)，應(yīng)盡量避免光漂白和光毒性，這些偽影會(huì)影響細(xì)胞活力和亮度。在這方面，應(yīng)選擇具有無(wú)快門(mén)、幀傳輸?shù)腅MCCD裝置 或行間 CCD 傳感器的相機(jī)，這些傳感器除了能夠提供慢速掃描數(shù)字信號(hào)外，還能夠以視頻速率提供連續(xù)的圖像流。

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